蚓激酶基因在牛乳腺中的表达.pdfVIP

枣謇畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三属学本研|寸会论文集 蚓激酶基因在牛乳腺中的表达2 刘殿峰¨张嘉保1张守峰2姚伟1扈荣良2 (1．吉林大学实验动物中心，吉林长春130062：2．军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062) 捅要：将含有蚓激酶基因的表这盒插入到逆转黎病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病 毒载舔，转染泌霉乙期奶牛乳腺小呻并获得暂对表达。利用脂震俸转染PA317包装细胞，G418进 行筛选得到了阳性细胞克隆，克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定，最高滴 度为1×104CFU／ml。进而用病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺小叶组织，产后奶样经FAPA法检测表 明翦l激酶基因已经整合到奶牛乳腺组织，并能实现相对稳定的表达。 关键词：蚓激酶；重组逆转录病毒；包装；转染；表达 自Gordon等fl】人首次应用转基因技术在哺乳期小鼠的乳腺中表达出入组织源性纤溶酶原激活 荆以来，通过转基因动物技术制造乳腺生物反应器生产重要的药熏蛋自的优越性和可行性几乎已达 成共识，但在临床I期或II期的试验中的转基因动物的产品却很少。尽管如此，通过转基因技术生产 于心脑血管病的治疗，健西前临床所需的毛K均是扶夷蠡鲟|体内壹接提取，其制备工艺繁杂，产壁较低。 因面通过基因工程手段生产大量窿纯度的LK已成为一种极有前景的途径。逆转录病毒介导的基因转 移技术是80年代初建立起来的高效基因转移方法，它借助逆转录病毒DNA载体与外源基因重组后经 包装细胞系产生缺陷性重组逆转录病毒，该病毒可以成功邋感染靶细胞，将外源基因整合予染色体 基因组中，并褥以在靶细胞中表达。本试验以逆转录病毒为载体将蚓激酶基因转入奶牛乳腺组织进 行了蚓激酶表达研究，为建立蚓激酶乳腺生物反应器及转基因奶牛奠定了基础。 1．材料与方法 1．1质粒、菌种和细胞 转秉病毒载钵pLNCL、E．coli 哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室孟庆文博士惠赠。 1．2分子生物学试和 基因工程工荚酶购皇大连宝生物公司；纾维蛋是原(F)和凝巍酶(室)购自中国药品生物制品 鉴定所(北京)；转染试剂Lipofectamine 培养基，G418购自SIGMA公司。 1．3实验动物 健康奶牛8只，2～3胎泌乳期2头，怀孕7个月奶牛6头，由长春华春肉牛集团提供并饲养。 1．4DNA的常规操作 质粒DNA韵提取、感受态的制备、DNA究隆、连接、束端修饰、转化帮鉴定等揉作按分子壳 隆实验指南瞄】进行。 1．5蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建 8T-LK及重组逆转录病毒载 以pcDNA3、pGEMT-bCP、含人工合成蚓激酶eDNA的质粒pMDl 体pLNC．LacZ为原始质粒，构建含蚓激酶的重组逆转录病毒表达载体。见图l。 2基金项目：国家“863”高技术研究发展计划(No．2002AA206653)基金资助 终纛楚分：刘殿峰(1963．)男，在读媾±，副教授，主要从事实验动物遗传育种与转基因动物方匿豹研究工作。 宰联系人； 刘殿峰，E—mail：—ccldf@1—63．com；电话：0431—7836553 巾爨喜羲簧黢学会澳物繁蓬学努会第十纛疆学术研讨会论文豢 耀{ 鲠粒pLN-bCP--LK鞴建繁臻 of Fig．1．ConstructionplasmidpLN-bCP．LK 1．6蚓激酶在泌乳期奶牛骢腺的错时表达 1．6．1转染奶牛莪腺熏簌织 将500rig重组质粒溶解在20ml灭菌生理盐水中，全部注射入一只泌乳期奶牛右侧后乳头中，采 繁涟射蘸的对照奶样和注射鼯3 1．6。2蓠|激酶活栏检测 Plate 采用纤维蛋自平板溶圈法(FibrinAgaroseAssay,FAPA)，参考文献疆1介绍的方法进行。将 放予湿盒内37。C溢育18h。 1．7脂质体奔导的瓣激黼重组逆转录病毒载体转染PA317细胞 转染嚣～天，用胰酶消化攀艨细胞，CO：培葬箱遍培养过夜至缨胞长满如锡一80％；转染蓠爝不 含盥清纛抗生索的DMEM培养液洗缁臆三次，以除去可麓