自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C-应用与环境生物学报.PDFVIP

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2017-12-30 发布于天津
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自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C-应用与环境生物学报.PDF

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自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C-应用与环境生物学报

2015-06-25 DOI: 10.3724/SP.J.1145.2014.12005 / Chin J Appl Environ Biol 2015 21 ( 3 ) : 427-434 应用与环境生物学报，自剪切及活性相关位点的组合突变提高头孢菌素C * 酰化酶水解活力 1, 2 2 2 1 2** 2** 2 梅婷张大龙冯进辉王敏吴洽庆朱敦明马延和 1天津科技大学生物工程学院，教育部工业发酵微生物重点实验室天津 300457 2 中国科学院天津工业生物技术研究所，工业酶国家工程实验室，天津市生物催化技术工程中心天津 300308 摘要 7-氨基头孢烷酸是合成头孢类抗生素的重要中间体，利用头孢菌素C酰化酶直接催化头孢菌素C获得7-氨基头孢烷酸的一步酶法与其它方法相比更加经济和环保，其关键是获得高活性的头孢菌素 C酰化酶. 本文以来源于 Pseudomonas sp. KAC-1的Ⅰ类头孢菌素C酰化酶（CPCase-kac）蛋白序列为模版，对其基因进行全局优化设计，人工合 pET28b CPCase-kac CPCase-kac 成目的基因，并克隆至表达载体，实现了的高效表达. 但是重组蛋白表达活性较低，且 CPCase-kac C CPCase-kac 自剪切不彻底，表达蛋白中存在前体形式的，而头孢菌素酰化酶的自剪切和活性往往相关. 对 Y150 Q220 F347 Q220W Q220G 分子中影响活性的、、氨基酸位点进行饱和突变发现，活力提高的突变体、其第二次自剪 Y 150R Y150N Y150H Y150W F347H F347Y 切明显降低，而活力提高的突变体、、、及、，自剪切却没有显著影响. 将这些突变进行组合，最终得到了比活力提高了8.3倍的突变体Y150W/Q220G/F347Y. 虽然Y150W/Q220G/F347Y突变体活性显著提高，但是其也具有Q220G较差的第二次剪切的特性. 同时发现，外部条件改变可以影响CPCase前体或α’亚基的继 CPCase-kac 6 2 41