QIAxcel毛细管电泳与常规琼脂糖凝胶电泳比较分析的研究.docVIP

精品论文 参考文献 QIAxcel毛细管电泳与常规琼脂糖凝胶电泳比较分析的研究 李欣 薛婧旎 唐益明 乔雪飞 陆晓红 杨丽华 　　（上海市松江区疾病预防控制中心 201620） 　　【摘要】目的：比较QIAxcel凝胶电泳与常规琼脂糖凝胶电泳两种方法的优势。方法：采集疑似手足口病患者的咽拭子50例，提取RNA，RT-PCR扩增EV71，产物分别用两种电泳方法观察结果，最后经RealTimeRT-PCR验证。结果：50例标本中QIAxcel凝胶电泳结果显示24例为阳性，阳性率为48%，常规琼脂糖凝胶电泳结果15例为阳性，阳性率为30%；阳性结果RealTimeRT-PCR验证也均为阳性。结论：QIAxcel凝胶电泳比常规琼脂糖凝胶电泳具有更高的灵敏度，且QIAxcel系统所具有的方便性和快速分析适合病原微生物检测。 　　【关键词】QIAxcel 电泳 琼脂糖凝胶电泳 　　【中图分类号】R332 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）16-0140-01 　　QIAxcel毛细管凝胶电泳仪是一台DNA/RNA的快速分析系统，通过虹吸作用进样，在具有特殊凝胶介质中通过毛细管电泳的原理[1]自动进行分离检测、分析结果；常规琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质，通过电荷效应和分子筛效应进行样品分离，再染色拍照分析结果。本文旨在分析两种电泳的优势，为实验室病原微生物的检测方法提供理论依据。 　　1 材料和方法 　　1.1材料 　　1.1.1 50例咽拭子标本来源于上海市松江区中心医院幼儿疑似手足口病患者。 　　1.1.2 核酸提取试剂盒High Pure Viral RNA Kit 购于QIAGEN公司 　　1.1.3 核酸检测试剂盒肠道病毒EV71 荧光PCR检测试剂盒购自上海之江生物技术有限公司，RT-PCR 检测试剂盒购自QIAGEN公司，EV71特异性引物由上海生工有限公司合成 　　1.2 仪器 　　1.2.1 ABI 7500 Real Time实时荧光PCR仪和RT_PCR扩增仪购自life tech公司 　　1.2.2 QIAcub核酸自动提取仪购自QIAGEN公司 　　1.2.3电泳仪购自北京六一仪器厂，凝胶成像系统购自美国伯乐公司 　　1.3 方法 　　1.3.1 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 用EV71特异性引物分别对标本RNA进行RT-PCR反应。反应条件设为；第1步：病毒RNA经AMV 逆转录酶50℃反转录30min；94℃变性3min，1个循环；第2步：92℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；第3步：72℃延伸5min，1个循环[2]。所用引物序列如下：EV71-1：5-GTC CTT AAT TCG CAC AGC ACA GCT-3；EV71-2：5-CGG TCC GCA CTG AGA ATG TAC CCA T-3,扩增产物为341bp。Real Time RT-PCR检测方法按照试剂盒说明操作。 　　1.3.2 电泳 　　1.3.2.1 RT-PCR产物先用1times;TAE 电泳缓冲液制备2.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，100V电压，电泳30～40 min。用凝胶成像系统分析相应PCR产物的条带并记录。 　　1.3.2.2 RT-PCR产物再用QIAxcel毛细管凝胶电泳，直接观察EV71特异性条带。 　　2 结果 　　2.1 50例标本的RT-PCR产物，QIAxcel毛细管凝胶电泳结果显示24例为阳性，阳性率为48%（24/50），电泳结果见图1；常规琼脂糖凝胶电泳结果有15例为阳性，阳性率为30%（15/50），电泳结果见图2。 　　2.2常规琼脂糖凝胶电泳15例阳性均与QIAxcel毛细管凝胶电泳结果一致，经Real_Time RT_PCR验证均为阳性；其中9例常规琼脂糖凝胶电泳结果为阴性，而QIAxcel毛细管凝胶电泳结果为阳性，经Real_Time RT_PCR扩增，9例也均为阳性。 　　 　　图1 QIAxcel毛细管凝胶电泳结果 图2常规琼脂糖凝胶电泳结果 　　3 讨论 　　 通过RT-PCR法检测50例咽拭子标本的EV71，分别用QIAxcel毛细管凝胶电泳与常规琼脂糖凝胶电泳两种方法读取电泳结果，二者阳性率分别为48%和30%，说明QIAxcel毛细管凝胶电泳敏感度更高。另外琼脂糖凝胶电泳需要配胶，制胶，插上胶梳，并检查正负极，且观察结果需要染色；而QIAxcel毛细管电泳仪，将样品管放入仪器后，几分钟内便获得高分辨率的电泳结果。因此，QIAxcel毛细管凝胶电泳不仅有更高的灵敏度