S腺苷甲硫氨酸SAM高产菌株的构建以及发酵优化研究.pdf

发酵工程学科的进展 ——第四次奎田发酵工程学术讨论套静主秉 s-腺苷甲硫氨酸(SAM)高产菌株的 构建以及发酵优化 胡辉，储炬+，钱江潮，张嗣良，庄英萍 (华东理工大学生物工程学院200237) 擅要：强化§辣苷甲磕氨畦(sAM)合成肆的表达是提商SAM产量时一十有效方法．未 F一盯缸6Ⅲ，，和Saccharomyces 再于Ecoil,Streptomycin cerevisiae曲sAM畚成晦基因在毕 赤酵母胞内袁逮，可使sAM产量提高200倍以上．进一步以这三个基因为模植．进行DNA 一株重组菌。摇瓶中SAM产量选到1．29／L，为出发菌株的300倍．在5L罐中曲培养表明． 氯谭，溶氯和I．-甲硫氨畦的漆加方式对SAM的产量有着较大影响．经过优化，SAM产量可 迭8．329／L． 关键词：SAMISAM合威肆；P．pastor／slDNASh“[fling；发酵优化 质，在体内起着转甲基、转硫基、转氨丙基等作用。作为生物体代谢的主要甲基供体， SAM直接参与了肌酸、肾上腺素、松果素和胆碱等重要生理活性物质的合成，并参与了 核酸和蛋白质的甲基化修饰。SAM也是谷胱甘肽、半胱氨酸、牛磺酸和辅酶A等含硫化 合物的活性前体，对维护人体健康至关重要[1】。 Schlenk等发现Ca划／dautilis，Saccharomycesc∞T口城4#等几种普通酵母，在相对 大量的L一甲硫氨酸(L-met)存在条件下，无论是否处于生长阶段，酵母细胞都可积累 sAM口】。因此利用酵母发酵，在培养基中添加L—met．是目前生产sAM的主要方法。 sAM合成酶是生物体内唯一已知的催化SAM合成的酶，其活性与生物体内sAM 水平有着直接的关系。为使毕赤酵母体内累积更多的sAM，本文人为的地加强了酵母 体内SAM合成酶的表达，尝试了几种不同的SAM合成酶基因，得到了SAM的高产重 组菌株，通过发酵优化之后显著的提高了SAM的产最。 1材料与方法 1．1菌株与培养基 Yeast 于Invitrogen公司。LB培养基(10jg／L Tryptone，59／Lextraxt，109／LNaa)用于 大肠杆菌培养，BSM培养基(o．939／LCaSO,，18．29／LK2SOt，409／L glycerol，4．139／L KOH。26．7ml／L 85％H，PO,，14．99／LMgS04·7I-L20，12ml／LPTMl，lml／L泡敌)用 *通讯作者：E．mail：juchw@ecust．edu∞ 第四次全国发酵工程学术讨论会 于酵母菌5L罐培养。 1．2重组DNA操作 限制性内切酶酶切，连接酶连接，PCR操作，大肠杆菌和酿酒酵母的总DNA抽提均 按照公司的产品说明书进行。大肠杆菌转化，质粒小量抽提按照文献3进行。链霉菌的 总DNA抽提按照文献4中所提供的方法进行。 PCR引物委托上海生物工程公司合成： coli E cerevisiae Saccharomyces Streptomycesspectabilis enzyme和GC 1rain，共30个循环，最后72℃延伸7min，采用Takara公司的LATaq 1．3 DNA Shuffling的实施方案 DNA Shuffling基因重组改造，PCR所用酶均为LATaqenzyme。 将扩增所得的重组基因文库通过Eco