TAT蛋白转导结构域跨膜递送机理及其应用基础研讨.pdf

TAT蛋白转导域跨膜递送机理及其应用基础研究 摘 要 TAT蛋白的转导结构域PTO(残基47-57)能介导外源蛋白跨膜递送进入 细胞，然而迄今为止，有关TAT-PTD的跨膜递送机制仍然不清楚。因此，构 筑并应用模型蛋白，探讨 TAT-PTO跨膜递送的机理及其应用，对充分发挥 TAT-PTD在临床治疗中的作用具有重要意义。 为构筑模型蛋白，本研究先通过PCR扩增 目的基因TAT-GFP，把鉴定正 确的目的基因 TAT-GFP与质粒 pGEX-2T连接，构建了带有 GST标记的 pGEX-TAT-GFP质粒。将其转化大肠杆菌BL21后，再把在大肠杆菌BL21大量 表达的GST-TAT-GFP通过GS-4B亲和色谱纯化，得到了分子量约为54.RD 的融合蛋白GST-TAT-GFP. 在此基础上，本文用荧光显微镜和荧光分光光度计来检测纯化后呈活性 状态的融合蛋白GST-TAT-GFP在不同条件下与体外培养的细胞作用，以探讨 TAT-PTD的跨膜递送机理。实验结果表明:①GST-TAT-GFP能有效跨膜递送 进入多种细胞，不仅能进入细胞质，而且可以定位到细胞核周围。②其递送 动力学特性如下:对时间和浓度有依赖关系，15min内就可以跨膜递送进入 Hela细胞，随着浓度的增加进入 Hela细胞的量也呈上升趋势;温度对 GST-TAT-GFP跨膜递送作用的影响巨大，37℃下可以顺利跨膜递送进入Hela 细胞，而4℃下的跨膜递送作用几乎被完全抑制。③代谢抑制剂实验显示， GST-fAT-GFP的递送作用可能是一种不依赖于能量的途径。④细胞膜表面硫 酸乙酞肝素对GST-TAT-GFP的跨膜递送有巨大的促进作用。 此外，本实验的研究结果证明了GST-TAT-GFP在进行跨膜递送时不但对 细胞膜没有任何千扰，而且对细胞活性没有影响。 最后，本文创新性地将具有活性的融合蛋白GST-TAT-GFP应用于研究活 体动物小 白鼠体 内的 TAT-PTD跨膜递送作用。腹腔注射实验表明 GST-TAT-GFP能跨膜递送进入到小白鼠的各个组织;皮肤涂抹实验发现 GST-TAT-GFP不但能跨膜进入小白鼠皮肤的表皮，而且可以进入其皮肤真皮 层。 总之，本研究不仅发现TAT-PTD是通过与细胞膜表面的硫酸乙酸肝素等 受体以低亲和力相结合后，跨膜递送进入细胞的，并且融合蛋白GST-TAT-GFP 对细胞没有毒性，还在组织水平上成功对TAT-PTD的跨膜递送功能进行应用。 这些结果为TAT-PTD在化妆品等领域的应用提供了理论依据。 关键词:跨膜递送，GST-TA下~GFP，丁AT-P丁。，融合蛋白，细胞 Mechanism for Cellular Internalization and Aapplication ofthe Protein Transduction Domain Abstract Theproteintransductiondomain(PTD)ofTATproteinwhichcomposedof11 aminoacid(47-57)canmediatetheintracellulardeliveryofheterogeneous proteins.Themechanismforitscellularinternalizationwasuncleartillnow.For itsimportantapplicationonclinictherapeusis,itsnecessarytostudythe mechanismforcellularinternalizationofTAT-PTD. Weconstructedtherecombinantproteinfirstlyasfollowingsteps.Thetarget geneTAT-GFPwasamplifiedbyPCRatfirst,thenthegeneidentifiedas TAT-GFPwasligated withtheplasmidpGEX-2T.Whentherecombinant plasmidpGEX-TAT-GFPwith GST tagwassuccesslyconstructed,we transformedittoE.coliBL21.ThefusionproteinGST-TAT-G