TRF技术检测聚丙烯酰胺凝胶中DNA条带的方法研讨.pdfVIP

随剂量增加均呈现出先升后降再升的特点，只是变化程度有差异。照射后细胞外基质成分的变化并不一 定遵从剂量依赖性效应规律。用X射线照射小鼠后14d，5Gy组肺组织I佃型胶原mRNA的比例升高． 而12．5Gy组肺组织I／ⅡId的比例则降低喁1。大鼠经中子照射后。肺组织四型胶原和三型前胶原的剂量 效应和恢复规律也存在类似的剂量效应背离现象。 中子照射后大鼠肾组织细胞中细胞外基质成分表达呈现出的复杂现象，究其原因。一方面是因为其表 达受射线诱发的细胞因子的调控，而不是射线的直接效应，另一方面，表达出的细胞外基质成分又受相 关水解酶的调控…。射线除了直接地损伤遗传物质外，还通过激发生成氧自由基或氮自由基引起次级损 伤．次级损伤通过TGF-B l№。、PAI—l…等细胞因子引发问质细胞转化为肌性成纤维细胞，从而过度分 泌ECM成分。另外，基质成分含量增加则可能是因为合成增加或降解减少。所以，ECM成分地大量表 达是射线的间接效应，其影响因素和表达规律均较复杂。 TRF技术检测聚丙烯酰胺凝胶中DNA条带的方法研究 孙项韩玲高福倪瑾 第二军医大学海军医学系放射医学教研室上海200433 I摘要1目的：建立时间分辨荧光技术检测DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳条带的方法。方法：以正常动物 稀土元素铕标记的链霉亲和素处理PCR产物，将处理后的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用时间 分辨荧光技术对凝胶中DNA条带进行检测，并将结果与银染进行比较，分析其灵敏度和可重复性。结果： 成功的建立了时间分辨荧光对聚丙烯酰胺凝胶中DNA条带的检测技术。时间分辨荧光技术能以很高的灵 敏度检测出凝胶中DNA条带，检测的条带位置与染色结果具有极好的对应性。结论：时间分辨荧光用于 电泳中DNA条带的检测完全可行，且具有高度的灵敏性、分辨率、可重复性以及半定量的能力。 关键词：镧系元素时间分辨荧光聚丙烯酰胺凝胶电泳 时间分辨荧光是80年代初期建立起来的一种荧光分析技术，该技术灵敏度高、专一性强、稳定性好， 同时还具有线性范围宽、样品用量少、分析速度快、样品荧光能重现和非放射性的优点。作为一种最有 发展前途的免疫分析法一直用于免疫分析和DNA杂交检测。DNA条带分析通常采用琼脂糖凝胶电泳， EB荧光分析，或者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳后用银染或者同位素自显影。本研究的目的在于利用时间分 辨荧光的高灵敏性，探究其用来检测聚丙烯酰胺电泳后凝胶中DNA条带的可能性。 I、材料 聚苯乙烯微孔板：Coming公司产品。 时间分辨荧光仪：1230Arcus型，芬兰Wallac公司产品。 3 Mini-PROTEAN 垂直电泳槽：65．3301 Electrophoresis，Bio-Rad公司，USA。 电泳仪：200／2．0 modle，BioRad powersupply 2510型变频振荡器：上海新波生物技术有限公司产品 RNA抽提试剂盒：购自上海华舜生物工程有限公司，产品编号：W6701 逆转录试剂盒：购自上海申能博彩生物技术有限公司 Bio-I1．dUTP：10mmol／1，购自上海华美生物技术有限公司 Eu3+标记的链霉亲和素，O．1mg／ml，芬兰Wallac公司产品 丙烯酰胺：Amresco 双丙烯酰胺：Amresco O．5M Tris碱和55g硼酸，40mlEDTA·双蒸水定容至lL。 10×TBE电泳缓冲液：1089 加样缓冲液：购自上海生工生物工程技术有限公司 TEMED Sigma 2、方法 76 细胞总RNA(按试剂盒内说明书进行)，．80C保存。 (3)引物设计 APl5’一AAGCTrGA丌GCC．3’ AP25’-AAGC丌CGACTGT-3’ AP35-AAGC丁丌GGTCAG．3’ AP45’-AAGCTTCTCAACG．3’ APs5-AAGClvIAGlAGGC