Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选.pdfVIP

Mpl基因RNA干扰载体的构建及荧光显微镜筛选 邹宇光1，莫玉叶1庞实锋1 张强2杨芳3易文君1，何国锋1喻巍巍1， 郑克勤1 1.广东医学院生物学教研室，广东湛江5240232.深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，广东深圳5180573.广州市禺山高级中 学，广东广州511400 [摘 要]目的：建立荧光显微镜快速筛选对血小板生成素受体(Mpl)基因RNA干扰片段的方法。方法：通 过体外重组技术将Mpl与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合基因，克隆进pDs载体中产生pDs-Mpl-GFP载体，将 人U6启动子及5个Mpl shRNA发夹结构(shMpl-A，shMpl-B，shMpl-C，shMpl-D，shMpl-E)分别克隆至pDs-Mpl- GFP真核载体中，构建出针对Mpl 5个不同位点的RNA干扰载体，然后将获得的上述干扰载体通过脂质体方法 转染至293T细胞中，用荧光显微镜观察293T细胞的荧光发光强度及荧光细胞数，判定构建的RNA干扰载体对 靶基因RNA的干扰效果。结果：构建的5个干扰载体都能对转染的293T细胞中的Mpl-GFP融合基因进行有效 的基因敲减作用，在pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A、pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-B与pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-E 的干扰作用下，293T细胞中的荧光强度及发荧光细胞数目变得更少和更弱，干扰效果较好，而其它两个效果较 差；在这三个较好的干扰载体中，pDs-Mpl-GFP-TK-U6-shMpl-A的干扰效果最好。结论：成功构建Mpl基因的真 核RNA干扰载体，并筛选出有效的RNA干扰片段。 绿色荧光蛋白；RNA干扰；基因融合 R342.82 A 1000 -2707 ( 2012 ) 06 -0587 -06 Construction of Mpl Gene RNA Interference Vector and Selecting Effective Mpl -specific shRNA with Fluorescence Microscopy ZOU Yuguang MO YuyePANG ShifengZHANG QiangYANG Fang YI WenjunHE Guofeng , YU Weiwei, ZHENG Keqin [基金项目]教育部科学技术研究重点项目(210156)，广东省大学生创新实验项目(KY1003)，广东省卫生厅青年基金(B2010235)，湛江市科技攻关项目 (2010C3111005),广东医学院博士启动基金(XB1007)。 ?-TK- 玎鉴定 为阳性克 5 under @@[ 1 ] Pang SF, Li XK, Zhang Q, et al. Interference RNA (RNAi)-based silencing of endogenous thrombopoietin receptor (Mpl) in Dami cells resulted in decreased hNUDC-mediated megakaryo- cyte proliferation and dif ferentiation [ J ]. Experimental Cell Research, 2009 (315) :3563 - 3573. @@[ 2 ] Zhang YP, Tang YS, Chen XC, et al. Regulation of cell differentiation by hNUDC via a Mpl-dependent mecha