人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰有效靶点的设计及筛选.pdfVIP

Research· ·基础研究·Experimental 85 人VEGF基因慢病毒介导RNA干扰 有效靶点的设计及筛选 丁治国1何蓓2陈晓珩1汪唐顺1高翔1李乃卿1 1北京中医药大学东直门医院外科(北京100700) 2北京中医药大学第三附属医院医务处 (北京 100029) 【摘要】目的：设计并筛选^血管内皮生长因子(VEGF)有效RNA干扰片段，构建VEGF慢病毒表达载体。方 法：对人VEGF基因编码区分析，筛选序列3条，阴性对照序列I条，通过连接线性化的plenti6．3一MIR载 体，构建miRNA慢病毒载体质粒，并转化至感受态细胞DH5oc，进行测序验证。在脂质体介导下转染 PCR 293T细胞，包装生产慢病毒，测定其滴度。幔病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L，用Real—time 检测干扰效果。结果：测序证实3个VEGF基因RNAi慢病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细 X1 胞包装成功，测定病毒的滴度分别为3．23×109,3．30×109,,3．730。TU／mL。3个慢病毒载体转染人肝 癌细胞MHCC97L后，VEGF基因在mRNA水平受到抑制，其中miR一200序列效果最佳，对VEGF基 因表达的干扰效率可达72％。结论：成功构建并筛选了人VEGF基因RNAi慢病毒载体及有效靶点，为 进一步深入研究VEGF基因与抗肿瘤药物药效关系提供实验基础。 【关键词】慢病毒载体·血管内皮生长因子基因·RNA干扰·MHCC97L细胞 【中图分类号】R730．5 【文献标识码】Adoi：10．39694．issn．1009—9905．2013．02．001 3)02—0085—04 【文章编号】1009—9905(201 and ofRNAinterferencelentiviralvector Designscreening ofhumanVEGF DING Zhi-gu01，HEBei2,CHENXiao-hen91，WANGTang-shunl，GAOXian91，LI Nai-qin91 of Aftiliatedto ofCld- 1DepartmentSurgery,DongztumenHospital BeUingUniversity nese Mechcine(BeUing100700,China) Amliatedto of 2Medical Third Cldnese University Department,TheHospital Belting Medicine(Beifing100029,Cluna) and of siRNAlentiviralvectorto itsfunc- 【ABSTRACT】Objective：Designscreeningclip clarify [基金项目]国家自然科学基金；北京中医药大学自主选题项目(201IJYBZZJS一020) [作者简介]丁治国(1978—01～)，男，山东青岛人，博士，副主任医师，硕士生导师，研究方向：恶性肿瘤的中西医结合治疗。 381 0390709 Tel：1 E-mail：dingzhiguo—l@yahoo．com．cn 中国现代普通外科进展2013年2月第16卷第2期 tions．Methods：Threea