EZH2基因3′非翻译区慢病毒载体构建及重组体筛选.pdfVIP

检验医学2013年6月第28卷第6期 LaboratoryMedicine，June2013，Vol28．No6 ·511 文章编号：1673-8640(2013)06~511-05 中图分类号：Q503 文献标志码 ：A DOI：10．3969／j．issn．1673．8640．2013．06．014 EZH2基 因3非翻译区慢病毒载体构建及重组体筛选 赵卫卫， 彭 攸， 李晓娇， 卢晓佳， 王玉平， 刘萃萃， 王璐璐， 冯 景 (南方医科大学附属奉贤医院检验科，上海 201400) 摘要：目的 构建携带人EZH2基因3非翻译 区(3UTR)的慢病毒筛选载体并实现该重组体在人乳腺癌 MCF-7中稳定整合，为下一步MicroRNAs(miRNAs)筛选奠定基础。方法 从组织中提取并用实时荧光定量聚 合酶链反应 (RT—PCR)扩增出EZH2基因3UTR，构建携带EZt12基因3UTR的重组慢病毒载体CTX．Lentivirus— EZH23UTR，脂质体法将重组的慢病毒载体和包装载体混合物共转染工具细胞293T细胞，包装产生慢病毒颗 粒。用裂解液裂解病毒颗粒，根据慢病毒载体上的CMV启动子表达量检测病毒滴度。用慢病毒颗粒感染乳腺 癌MCF一7细胞后，通过嘌呤霉素筛选稳定整合的乳腺癌细胞 MCF．7，用Real—TimePCR和Westernblotting方法检 测EZH2基因3UTR是否整合入细胞 MCF一7中。结果 PCR扩增检测阳性菌落和测序结果证实，EZH2基因3 UTR成功定向克隆到慢病毒载体上。Real—TimePCR检测病毒滴度为4．3×10拷贝／mL。筛选稳定整合MCF一7 细胞的最佳浓度为0．2 mL。重组慢病毒转导MCF一7后，Real—TimePCR和Westernblotting方法分别检测EZH2 基因3uTR整合到乳腺癌细胞 MCF-7基因组 中。慢病毒感染实验组和对照组比较，差异有统计学意义 (P 0．01)。结论 成功构建携带EZH2基因3UTR慢病毒筛选载体，实现重组体在乳腺癌MCF-7细胞中稳定整合。 关键词：EZ112；非翻译区；慢病毒载体 ；MCF-7 Theconstructionoflentivirus-EZH23UTR vectorandthescreeningforitsrecombinant ZHA0 耽 ． PENGYou，LIXiaojiao， Xiaofia，WANGYuping， Cuicui，WANGLulu，FENGJing． (DepartmentofClinical Laboratory，FengxianHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity，Shanghai201400，China) Abstract：0bjective ToconstructlentiviralvectorcarryinghumanEZH23untranslatedregion(UTR)and maintainitsstableintegrationofrecombinantinMCF一7cellsofbreastcancer．andtolaytheofundationforthefurther screeningofMicroRNAs(miRNAs)．Methods TheEZH23UTRwasextractedandamplifiedbyreal—timefluorescence quantitationpolymerasechainreaction(RT—PCR)，andwasconsturctedintorecombinantlentiviralvector，CTX． 1entivirus—EZH23UTR vector．The293Tcellswereeontransfectedwiththerecombinantlentiviralv