猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc145细胞中的表达研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集(2006年广州) 注：ND为没有检测到DPVoDNA 表2皮下组不同时间死亡鸭不同组织中DPV-DNA基因组拷贝数检测结果的平均对数值(109copies／g) Tab．2ResultsofDPV-DNA indifferenttissuesfromdeadducksinfected logcopies／g subcutaneously 参考文献(编者略) 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗的构建及其在Marc．145细胞中的表达 希尼尼根“3，程安春“”，汪铭书“2，陈希文1．2t豆文波“2，李雪梅“2，刘伍梅I,II刘菲2，张平英“2，陈孝跃“2 (1．四川农业大学动物科技学院，2．动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川雅安，625014) 3．内蒙古农业大学动物科学与动物医学学院，内蒙古呼和浩特010018) Marc-145细胞，间接免疫荧光技术跟踪监测ORF5基因的表达情况表明，脂质体转染法和电穿孔转 染法分别在转染26 h和23h后检测到ORF5基因特异性表达产物，随着培养时间的延长，特异性表 和四川省重点建设学科项目(SZD0418) ’程安春为通讯作者，TEL：0835·2885774，FAX：0835-2885774，E．mail：堂塑g丛曲婴@!迫：!鳗：￡Q皿 616 中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第八次学术研讨会论文集(2006年广州) 达，这为PRRSV基因疫苗在临床上应用提供了理论依据。一 关键词：PRRSV，ORF5，基因疫苗，Marc．145细胞，表达 ’ 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSv)引起猪的生殖和呼吸系统 综合征。该病以母猪发热、厌食和流产、死胎、木乃衣胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和 高死亡率为特征，该病发病率高、传播快，严重危害养猪业的发展。目前使用的灭活苗和弱毒苗存在 这样那样的不足，如弱毒疫苗有可能引发猪群PRRS疫情的发生，灭活苗安全性较高但其效果远远不如 弱毒苗等，因此有必要开发新型疫苗，各国学者都致力于获得一种更安全、高效、廉价的新型疫苗。 PRRSV全基因序列的成功测定及其分子生物学特点的深入研究为该病基因疫苗的诞生提供了可能。 蛋白，它可在体内诱导产生病毒中和抗体，因此，ORF5基因是基冈疫苗重要的候选基因。 pcDNA．PRRSV-SC I-ORF5采 用脂质体和电穿孔技术，转染到Marc．145细胞中，研究其在体外细胞中的表达情况，为进一步研究 该疫苗在临床上应用提供基础数据和实践依据。 1材料与方法 1．1材料 省重点实验室保存。 1．1．2克隆、表达的载体和宿主菌克隆载体pGEM．T，上海联合基因公司产品；真核表达载体 ， pcDNA3．1(+)，Invitrogen产品：JMl09由本实验室保存。： anti-Rabbit 1．2方法 1．2．I病毒培养和核酸的提取 按常规方法培养Marc．145细胞，待细胞生长至单层后分别接种 15min，4C DEPC水重悬病毒总RNA，55℃水浴15min，．20℃保存备用。 心管倒置风干15min。最后加10pl 1．2．2引物的设计根据PRRSVLV和VR．2332株的核酸序列设计合成一对包含完整ORF5基因序 列的特异性引物，并在上、下游引物的5’端分别添加BamHI和EcoRI位点，扩增产物预期长度为 3’；下游引物为5-CCGAATTCC册GGGCATATATCATCAC一3’ 1．2．3 ORF5基因的扩增 于PCR管中依次加入无核酸酶水26．Op．1、5x反应缓冲液10．0“l、