猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的表达研讨.pdfVIP

摘要 猪繁殖与呼吸综合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome,PRRS) 是20世纪80年代末发现的一种高度传染性疾病，引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊 胎等繁殖障碍症状，以及各种年龄猪(特别是仔猪、的呼吸道症状，其病原为猪繁殖与呼 吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus,PRRSV)。PRRSV 是单股正链RNA病毒，与马动脉炎病毒、鼠乳酸脱氢酶增高症病毒和猴出血热病毒同属 于最近成立的动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。PRRS\基 因组长约15k6，包括8个开放1阅读框架(ORFs)，ORF1a和ORF16编码病毒复制酶，ORF2-5 分别编码病毒的糖蛋白GP2--GP5,ORF6编码膜蛋白(M蛋白)，ORF7编码保守性的核衣壳 蛋白(N蛋白)。根据抗原性不同将各地PRRSV分离株分为欧洲型(原型毒株为LV)和北美 洲型(原型毒株为VR-2332)。 囊膜蛋白GP5是PRRSV的主要结构蛋白和主要免疫保护性蛋白之一，有许多独特的 生物学和免疫学功能，在病毒的致病和机体的抗病毒免疫中发挥着重要的作用。因比， 我们克隆了PRRSV广东株ORF5基因，对ORF5基因进行了测序，在此基础上构建了ORF5 基因的原核表达质粒ORF5-pBAD/gm，并在大肠杆菌中进行表达。随后，我们又构建了 ORF5基因的腺病毒表达质粒pAdCMV-ORFS，对其进行了鉴定。 (1)原核表达系统 根据已克隆的PRRSV广东株ORF5的基因序列，设计了能够扩增ORFS基因的一对含 有ApnI和肋:工双酶切位点的引物，经PCR枝术从pMD-ORF5质粒中克隆出大小为602hp 的基因，将此基因克隆到pBAD-gIIIC表达载体中，构建了表达质粒ORF5-pBAD/gIIIC转 化入大肠杆菌TOPIO，用IPTG进行诱导表达，结果表达出约22kD的融合蛋白，蛋曰大 小与设计相符，经WesternBlot免疫印迹分析，该蛋白能与invitrogen公司所提供的 带六个组氨酸的抗体反应。 (2)真核表达系统 根据已克隆的PRRSV广东株ORF5的基因序列，设计了能够扩增ORF5基因的一对含 有hpn工和XbaI双酶切位点的引物，经PCR枝术从pMD-ORF5质粒中克隆出大小为602bp 的基因。将PCR产物和腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV用KPi，工和 AfiaI双酶切，经酶 切的ORF5基因和穿梭载体pAdTrack-CMV连接后用热激法转化E.coliDH5a，进行PCR 和酶切鉴定。将获得携有PRRSVORF5基因的重组穿梭质粒线性化后与腺病毒骨架载体 pAdEasv共转染E.coliBJ5183，使之发生同源重组，经PCR,酶切鉴定后获得重组的腺 病毒质粒，最后用PacI酶切线性化，与脂质体共转染入293细胞，获得含PRRSVORFS 基因的重组腺病毒。 关键词:PRRSV;ORF5基因;原核表达:重组腺病毒 Abstract PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus(PRRSV)isthecausativeagentof PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome(PRRS),anewlyrecognizedpigdiseaseof economicalimportance,characterizedbyreproductivefailure(abortions,stillbirths,mummied fetuses)andrespiratoryproblemsinanyage.WeisolatedGuangdongstrainofPRRSVand sequencedORF5gene.WeconstructedrecombinantplasmidORF5-pBAD/gIIIand expressedinEcoli.WeconstructedrecombinantplasmidPAdCMV-ORF5andidentifiedit. (1)Expressioninprokaryotesystem AccordingtothecompletesequenceofAmericanPRRSV,apairofprimerst