猪水疱病病毒基因组全序列分析及VP2基因在大肠杆菌中的表达研究.pdfVIP

猪水疤病病毒基因组全序列分析及VP2基因 在大肠杆菌中的表达 摘 要 研究和分析SVDV基因组一级结构是深入研究SVDV的基础，通过基因重 组技术表达SVDVVP2基因抗原区的蛋白，为建立以重组蛋白为检测抗原的猪 水疙病诊断方法奠定了基础。本研究包括以下两方面的内容: 1.SVDV基因组全序列分析 应用RTPCR技术获得SVDVHK70分离株覆盖全基因组的6个cDNA片 段，序列测定后得到全序列。此序列经计算机分析后表明，该毒株基因组全序列 长度为7401nt(polyA尾巴除外)，大开放阅读框架的长度为6555nt，编码一条 由2185个氨基酸组成的多聚蛋白。5NCR和3NCR(polyA尾除外)长度分别 为743nt和 103nt,1A,1B,1C,1D的长度分别为207nt,783nt.714nt和849nt, 2A,2B,2C的长度分别为450nt,297nt和987nt,3A,3B,3C,3D的长度分 别为267nt,66nt,549nt和1386nt。序列比较结果表明，HK70与己发表的SVDV Jl73,SVDVH/376,SVDV (Seerchurn.P等测株)，SVDVNET/1/92等株的核 昔酸序列同源性分别为98.4%,98.2%,98.2%和91.0%;与柯萨奇病毒CVB1, CVB2,CVB3,CVB4,CVB5,CVB6的核昔酸序列同源性为76.0%-80.4%a 与SVDVJ173,SVDVH/376,SVDV (Seerchum.P等测株)，SVDVNET/1/92 等毒株氨基酸序列同源性分别为98.9%,98.9%,99.0%和96.9%;与柯萨奇病 毒CVB1,CVB2,CVB3,CVB4,CVB5,CVB6的氨基酸序列同源性为88.4%一 953%。 2.SVDVVP2基因在大肠杆菌中的表达 应用RTPCR技术，以SVDVHK70为材料，扩增出结构蛋白VP2基因。 酶切PCR扩增产物并与表达载体pGEX4T1连接，转化BL21菌体并提质粒， 将经酶切，PCR鉴定为阳性的重组质粒命名为pGEX-VP2。检测结果表明，目的 基因插入的位置、大小和读码框均正确，表达载体构建成功。将含有阳性质粒的 BL21菌液经IPTG诱导后进行SDS分析，结果表明VP2基因在大肠杆菌 中得到高效表达，表达量最大时目的蛋白占菌体总蛋白的30%左右，Westrenblot 检测表明该蛋白能与SVDV阳性血清结合，具有免疫活性。 关键词:SVDV，全序列，同源性，VP2基因，表达 Analysisingcompletenucleotidesequenceofswinevesicular diseaseandExpressionofVP2geneinE.Coli. Abstracts Wecanstudydeeplyvirusbyresearchingandanalyzingpreliminarystructureof virus.Proteinexpressedbytechniqueofgeneengineeringisbasicofdiagnosising SVDV.Thisstudyincludestwosidesofcontents: 1.Analyzingcompletesequenceofswinevesiculardiseasevirus(SVDV): AcquiringsixoverlappingDNAfragmentsrfomSVDVRNAbyRT-PCR-These fragmentsweresequenced.ThelengthofcompletenucleotidesequenceofSVDV HK70is7401nt，thelengthofORFis6555m,encodingpolyproteinthatis 2185aa.Lengthesof5-NCRand3-NCRare743ntand103ntrespectively,Lengthes ofIA,1B,1CandIDare207nt,783nt,714ntand849ntrespectively;Lengthesof 2A,2Band2Care450m,297nt,987ntrespectively;Lengthesof3A,313,3Cand 3