猪细小病毒NS1基因的克隆及真核表达载体的构建研究.pdfVIP

中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 269 猪细小病毒NSl基因的克隆及真核表达载体的构建 苏晓健，扬润德’，王琳，孙向华，程龙．陈丽君 (河北农业大学动物科技学院保定071001) 摘要：以猪细小病毒基因组DNA为模板．利用特异性引物。通过聚合酶链武反应(PCR)扩增出NSl奎基 中，酶切鉴定之后，将该重组质粒经BamHI和EcoRI双酶切处理。与同样处理过的寞核表达载体pcDNA3．1进 行连接，成功的构建了真核表达载体pcDNA_NSl。 关键词：猪细小病毒。NSl基因，真桩表达载体，构建 猪细小病毒为引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，其感染的主要特征是导致母猪发生流产、死 胎、胎儿木乃伊化及新生仔猪的死亡，给养猪业带来重大危害…口J。NSl是主要的非结构蛋白，在细小 病毒中高度保守，对PPVDNA的复制以及病毒早期和晚期的转录都发挥着很重要的作用”1；NSI还可 以抑制宿主细胞DNA的复制和多种异源性启动子，发挥细胞毒性作用，表现出抗肿瘤活性；NSl蛋白 还具有抗原性，已有人成功的对其进行了原核表达。 酶切，最后将其与通过同样酶切的真核表达载体pcDNA3．1进行连接，成功的获得了真核表达载体 pcDNA—NSl，以研制出一种新型的核酸疫苗。 1材料与方法 1．1试剂及细胞株 DNA 提取试剂盒购白北京天根生物公司。 1．2引物 根据文献Ⅲ。设计l对包含NSI完整编码区的特异性引物，上游引物中含BamHI限制位点，下游 引物中含Sacl限制位点，引物由大连宝生物工程公司合成。引物序列如下： PI：5’AGC旦坠鲫GcATGGCAGCGHGGAAAC3’ P2：5’GTC堡垒堡￡丛了兀TGCTGCGGCGTCTGA3’ 1．3方法 1．3．1病毒的增殖及血凝滴度的测定 按常规方法培养PKl5单层细胞，细胞生长至12小时，接种细小病毒病毒株，每日观察细胞病变 (CPE)。当80％以上细胞出现病变后，倒掉病毒液，将细胞冻存于一80C，冻融三次，将细胞泥用维持 液洗下，装入青霉素瓶中，超声波破碎，用0．6％豚鼠红细胞测血凝效价。 1．3．2PPVDNA的提取“ Tris HCL，ImMEDTA， 过夜，12000r／rain离心，70％乙醇洗涤3次，自然干燥后用200山TE(10mM pH8．0)溶解，-20(2备用或直接用于PCR。 1．3．3目的基因的PCP-扩增与回收 270 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 PCR扩增反应体系为： 模板DNA(0．3 3；L 上游引物(10pmol／止) luL ug／／_LL) 下游引物(10pmolIgL) 1pL dNTP(各2．5raM) 4ul buffer 1儿 10xPCR 5止 Taq酶(5u，皿0 灭菌去离子水 35uL PCR扩增反应参数为： 4C 1分钟，退火581分钟，延伸72℃2分钟，共30个循环；最后 95℃预变性5分钟；变性94。C 72C延伸10分钟。反应完毕后，取39LPCR产物用0．8％琼脂糖凝胶电泳检查扩增。 1．3．4pcDNA．．NSl真核表迭载体的构建 NSl PUCl9 1．3．4．1质粒PUCl9的构建及鉴定”】：将回收的 基因片段与 lSN_切内性制限用别分体载