猪卵母细胞玻璃化冷冻后细胞骨架的变化研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三腾学术研讨会论文集 猪卵母细胞玻璃化冷冻后细胞骨架的变化 武彩红，芮荣‘，戴建军，谢冰，剧世强，卢晓 (露寨农业大学动物医学院，江苏南京210095) 摘要：本试验旨在研究玻璃化冷冻后猪卵母细胞纺锤体、染色体争微丝的变化。从屠宰猪卵巢表 面直径2—5伽卵泡中采集米成熟(GV期)卵母细胞，由GV期卵母细胞经成熟培养获得体外成熟(MII 期)卵母细胞。Gy期和黼II期卵母细胞各分为3组：对照组、冷冻保护荆处理组和玻璃化冷冻纽。 MI I期费母细胞经分组楚璎瑶直接用于激光扫描共聚焦蔓微镜氇SC约样本；而G￥期卵母善翳胞处理 后先经44h成熟培养，再用作LSCM样本。供试卵母细胞经圈定、免疫荧光染色后，于LSCM下观 察。结果表明，冷冻保护剂处理组GV期卵母细胞经成熟培养后，其纺锤体结构、染色体排列与微丝 0．1％、36．4％ 分布正常率分别为42．9％、89．6％和28．6％，玻璃化冷冻组此3项指标的正常率分别为1 争16．9％，两组问差异显著(P0．05)；除冷冻保护剂处理缎染色体正常率与对照组无异外，两试 保护剂处理组的纺锤体结构、染色体排列与微丝分布正常率分别为34．4％、61．3％和47．9％，而冷冻 本试验结果表明，猪GV期和MⅡ期卵母细胞经冷冻保护剂处理或玻璃化冷冻保存后，均造成了纺锤 依、染色俸和微熬不百逆酌损伤，这可能是影响奔母细胞成熟、受精与发育的重要原因。 关键葫l：猪；卵母细胞；玻璃化冷冻；细胞骨架；激光扫描共聚焦显微镜(LSCM) 随着哺乳动物生殖生物学技术鹃发展，动物卵母细胞的冷冻保存，在动物种质资源保护上滔益 显示出强大的应用潜力。多种动物卵母细胞已被成功冷冻【ll，但其冻后的受精率、发育率仍远远低 于新鲜卵母细胞。有很多因素影响卵母细胞的冷冻保存，在这些因素中，卵母细胞的自身结构及其 功能变化，韪一个不可忽视的重要因素。研究表明，多数哺乳动物MII期卵母细胞纺锤体对低温特 别敏感，当卵母细胞被冷却至室湿或更低温度时，构成纺锤体的微管发生部分或全部解聚，进丽导 min后完 致染色体分布异常，影响其后的受精与发育【2，3，4J。小鼠卵母细胞纺锤体在0℃维持45—60 全解聚翻；人卵母细胞纺锤体在室温或更低温度时，也发生部分或全部解聚N1。尽管复温后卵母细胞 纺锤体可发生恢复，健恢复程度在复温后培养肘闻和动物种类上均有很大差异}5’7引。处于GV期的 卵母细胞，其纺锤体尚未形成，但研究发现该期卵母细胞冷冻后，存活力与发育能力也有降低瞄一， 相关原因仍有待查明。 straw)法玻璃化冷冻，是新近发攫起来的一种震于噙乳动物涯胎和郛母细胞 OPS(openpulled 冷冻保存的方法。由予其冷冻速率快、冷冻液用量少，有助予降低卵母细胞的冷冻损伤，是当前用 于卵母细胞冷冻僳存的理想方法之一{l】。近年来，本实验室对猪卵母细胞冷冻保存进行了系统研究， 冷冻研究结果表甓，猪GV斓与体井成熟Mll期卵母细脆在经OPS法玻璃仡冷冻螽，存活力与体外 受精胚发育能力与新鲜卵母细胞相比均有明显下降，GV期与MII期卵母细胞间也有明显差异，以 GV期卵母细胞冷冻保存效果为佳。为了迸一步查明冷冻损伤的机理，作为该系统研究的一部分，本 试验侧重对猪郛嚣缨胞冷冻后，英纺锤体结构、染色体排列与微丝分布进行比较分析，瑷澄清卵母 细胞玻璃化冷冻后，对细胞骨架造成的影响，为进一步探讨影响猪卵母细胞冷冻保存的机理提供实 验参考。 025Emml,rrui@njau．edu．cn。 孛慝畜牧兽医学会动物繁蹙学分会第十兰届学术研讨会论文集 II 1材料与方法 1．1卵母细胞来源 GV期郛母细胞是用捶吸法从屠宰猪卵巢表蓠直经2—5lllln卵泡申采集，选月胞质均匀、包被3 下培养44h。 1．2猪GV期与MII期卵母细胞的冷冻保存 本试验所用MII期郛母细胞，均盘GV期卵母缨耱体外成熟培养后获得。以0．1％透明质酸酶溶 液处理MII期卵母细胞约5min，并经吸管吹打去除扩散的卵丘细胞，经TCMl99培养液洗2～3次 后