猪卵母细胞冷冻保存研讨.pdfVIP

中国奢牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学本研讨会论文集 猪卵母细胞冷冻保存研究 2 张德福扎2刘东“2王邵凯3王少兵3汤琳琳b (1’上海市农亚科学院畜牧兽医研究所，上海201106； 2’上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海201106： 郭南京农业大学动物科技学院，南京， 252100) 捅 要：【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素(FDA)染色鉴 定卵母细胞冷冻后的存活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同 冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】(1)程序化法冷冻保存中，3种冷冻 显著高于对照组《存活率33．8％，25．8％，23．5％vs2．5％，PO．01)，且以EG的效果最好，显著高 于另外睡组(33．8％vs 冷冻的较好方法，以普通盼麦管(Straw)法进行的程序化冷冻为对照组，GMP管法显著提高猪卵母 GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著(存活率分别为30。O％和 59．7％，尺0．05)。冷冻后继续培养，分别有2．8％和6．3％的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。(5)冷冻 对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4．9％的受精卵分裂，极显著低 于对照组的||9．5菇(P0．01)；发育歪4一细胞期的比例为1．7％，未能发育互8一细胞期以上胚胎。 关键词：猪；卵母细胞；冷冻保存；体外受精 近年来，随着动物胚胎生物技术(如核移植、体外受精、胚胎体外生产等)的迅速发展，对卵 母细胞的需求日益增加，仅通过回收体内成熟卵母细胞已经无法满足科硪秘生产的需要。蕊从屠宰 场回收废弃卵巢加以利用以获取大量卵母细胞，可望成为一条方便、快捷和有效的途径；猪卵母细 胞冷冻保存有助于我国优良地方猪种种质资源的保护，有助于资源共享与交换。 动物卵母细胞是母系遗传信息的载体，通过冷冻保存动物的卵母细胞，不但可以建立雌性动物 的基因库，还可充分利周卵母细胞资源，使体终受糖、转基因和核移植技术研究不受时阀帮地域的 限制。另～方面，通过体矫受精实现胚胎的体外生产，也可为胚胎生物技术提供丰富的材料来源； 通过“试管动物”的生产，为克服珍稀濒危动物的生殖疾病提供良好的解决方案。猪卵母细胞冷冻的 研究还可为丰富低温生物学的理论、方法和实践，提供重要的依据。迄今为止，猪卵母细胞的冷冻 保存仍是一个世界性难题，猪的卵母细胞由于莠旨滴含量离、对低温冷冻十分敏感珏翻。总的看来，相 关的研究资料相对较少，其冷冻．解冻后的存活率仍然偏低，长期保存的技术难度仍然很大。本研究 利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、FDA染色、体外成熟和体外受精等为卵母细胞存 活指标，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。’ 1材料与方法 基金硬翻：上海南科技兴农重点攻关顼磊(沪农科攻字(2003)第14．1号)、上海市农遭科学院青年科技 基金、德鬟BMBF(编号No：CHN99／31国基金资助。 作者简介：张德福(1963一)，男，上海人，研究煲，硕士，研究方向为动物胚胎生物技术研究， 串匿畜牧甍医学会动物繁殖攀分会第十三援学术磅讨会论文集 实验中所用的试剂除特殊说明外，均来自Sigma公司 l。t猪卵母缨脆的采集和体外成熟培养 卵巢采集于上海市长宁区复兴屠宰场。卵母细胞的采集和体外成熟培养按本实验室方法进行【3“】。 1．2 冷冻液的制备和保存 制成EFS20和EFS40tsJ。保存于4℃。 蔗糖：溶于羯S(含15％FCS)中，使其浓度分剐为0．5mol。L1，过滤磊40保存。 分别为3％、6％、9％；DMSO和Gly浓度分别为5％、10％。过滤除菌后4口保存。 1．3 GMP(glassmieropipette)管静拉依l 将蛊径为0．25--0．40cm的玻璃管在酒精嚣外焰上加热煅烧，当煅烧部分变得很柔软詹，脱离 火焰用双手掇住玻璃管两端迅速向相对的方向牵拉，拉制成200--3001am的微管，用作胚胎或卵母 细胞冷冻载体。 王。4超低温冷冻 1．4．1程序化冷冻 (1)方法将GV期或MII期卵母细胞在TCMl99中洗2～3次，转移到冷冻保护帮乙二