猪抵抗素resistin表达载体的构建、表达及表达产物的纯化鉴定研究.pdfVIP

第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编 动物实验 猪抵抗素(resistin)表达载体的构建、表达及表达产物的 纯化鉴定 冷扬1’2，刘铀2，刘艳芬3，王群3，潘颖斌3，高志杰3 (1．广东医学院实验动物中心，广东湛江，524023；2．广东海洋大学现代生物化学中心，广东湛江，524088； 3．广东海洋大学农学院，广东，湛江，524088) blot 检测证实是resistin蛋白，并用镍离子亲和层析的方法获得纯化的Resistin蛋白。 【关键词】抵抗素；蛋白表达：纯化 抵抗素(resisti)是Steppan等…发现的一种由脂肪细胞特异性分泌的促胰岛抵抗的信号 分子，它的发现引起了学术界极大关注。猪resistin编码区序列长度为330bp幢。，编码109个 氨基酸的多肽，分子量约为12．5kDaⅫ。。猪的resistin基凶可能位于2号染色体上。 表达情况差异较大；给予重组resistin可调节体脂分布，给予resistin抗体可中和上述生理 活性。4。；体外实验显示，resistin可调节3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取水平和转运能力怕1。 以上研究表明，resistin可以作为信号分子调节机体脂肪生长发育和分布沉积。 近些年来，国内外对resistin的报道不断的更新，但就其功能及表达等方面的报道仍存在 分歧，而且，国内仅有人和小鼠等少数生物的resJstin基因被克隆并表达，本研究旨在在国内 率先克隆到RSTN基因，将其在大肠杆菌中表达，并将获得的可溶性重组resistin蛋白纯化鉴 定。为进一步研究resistin的作用机制及对猪脂肪代谢的调节功能奠定一定的基础。 1 材料和方法 1．1 材料 大肠杆菌EcoliDH5 a，大肠杆菌BL一21(DE3)；pET-32a(+)质粒，均由本实验室保存； RSTN基因序列由本实验室从猪腹部皮下脂肪组织中克隆所得；屁。_研、胁硼I均为华美生物工 程公司产品；蛋白质纯化树脂50％Ni-NTA购自Qiagen公司；TaqDNA聚合酶及缓冲液、蛋白质 分子量标准、DNA片段快速纯化／回收试剂盒均为北京鼎国生物科技有限公司产品；硝酸纤维素 薄膜购自6elman science公司；质粒DNA抽提试剂盒均为大连宝生物公司产品。 1．2 方法 1．2．1 Resistin表达载体的构建 7一GCG从TTCATGA 根据本实验室克隆的RSTN基因序列，设计一对引物B23／B22。B23：5 370 动物实验 第七届中南地区实验动物科技交流会论文汇编 TGT 7一GCAAGCTTCTATGGAGTTCTC从T AGGCTTTGTCCT TG一3’：B22：5 C。3’。弓I物由 上海英骏生物技术有限公司合成。 rain s，52℃40S、72℃l 30个循 PCR反应程序为：94℃3min，1个循环；94℃40 8 环；72Cmin，1个循环。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；扩增产物和原 DNA连接酶的进 核表达载体pET-32a(+)分别用EcoRI和HindJJ双酶切，电泳回收纯化后用T4 行连接。 连接产物转化DH5G感受态细胞，铺LA平板，37。C培养过夜，挑取菌落扩大培养，采用 PCR方法对含RSTN基因的转化子进行筛选；阳性转化子提取质粒后，进行酶切鉴定；重组质粒 pET-RSTN送上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。 1．2．2 不同诱导时间、不