猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体研制研究.pdfVIP

第六展理事会第二次会议置教学专生委员会2006年会议论文集 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中和性单克隆抗体研制 马苏，姜平·，段舒怡，李玉峰 (南京农业大学农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏南京210095) 摘要目的研制猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的单克隆抗体(McAb)．方法将GP5基因克隆入真 蛋白单抗．建立闽接ELISA方法筛选阳性克隆。并对杂交瘤细胞株进行鉴定，分析单抗特性．结果获得 3株可分泌特异性抗PRRSV 同时用Western GP5蛋白的单克隆抗体，为进一步对PRRSV诊断和免疫预防研究奠定了重要基础． 关键词猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)；GP5蛋白；质粒；单克隆抗体、中和抗体 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PI讯SV)是引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道疾病的重要 病原，已造成世界养猪业严重经济损失。PRRSV属动脉炎病毒科，动脉炎病毒属；为有囊 膜的单股RNA病毒。PRRSV按血清型不同可分为为美洲型和欧洲型。病毒含有9个开放式 编码糖基化膜蛋白GP5ll’2叫。GP5蛋白为病毒的主要糖基化结构蛋白，具有6个抗原决定 簇，其中有一个有血清特异性的线性决定簇，能在体外中和病毒的感染，与病毒免疫保护作 用有关。目前国外已研制出分别针对PRRSV各种蛋白的多个单抗，有的并投入应用【4】，我国 也已研制成功多个单克隆抗体，但尚米见中和性单克隆抗体的报道。本试验采用GP5基因 免疫小鼠，研究制备了两株抗GP5中和性单克隆抗体，为该病诊断和免疫防制奠定基础。 l材料和方法 1．1主要材料 化学发光显色试剂盒购自PIERCE公司。 1．2病毒增殖与纯化 120，000xg离心3h，收获病毒带于．20C保存备用。 1．3免疫动物 剂量为每次100·200lag／只，背部皮内免疫，共免疫4次。第1次和第2次间隔3周，以后免 疫都间隔2周，剂量相同。第4次免疫后一周，进行融合。 1．4间接ELISA方法的建立 用纯化的PRRSV作为抗原，按常规方法建立间接ELISA法，通过方阵滴定确定抗原包 被浓度和阴性、阳性血清(S一、S+)最佳工作稀释度。 1基金项目：国家自然科学基金，新世纪优秀人才资助计划，教育部博士点基金项目 【作者简介l马苏(1982一，，女(回族)，江苏南京人，在读于南京农业大学动物医学预防善医专业，硕 士。主要从事动物传染病防制及动物病毒分子生物学研究。E—mai l：happvms穗163．tom ．189． 猪传染病 1．5杂交瘤细胞株的建立 按常规方法【6】进行，对用间接ELISA测得为阳性的克隆细胞采用有限稀释法，进行3 次亚克隆。 1．6腹水的制备 取10周龄BALB／c小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡0．5ml／只，lOd后经腹腔注射杂交瘤细胞， 2×106个／只，1周后小鼠腹部增大，收集腹水，5000r／rain离心10min，收集上清液，分装，-20C 冻存。 1．7McAb的亚类的鉴定 采用MouseMonoclonal Kit试剂盒，按说明书进行鉴定。 AntibodyIsotyping 1．8间接免疫荧光试验 37℃培养，24～48小时，弃 将PRRSV病毒接种于长满单层的MARC一145细胞，5％C02 鼠lgG荧光抗体，37℃作用lh，洗涤3次，于荧光显微镜观察。 1．9免疫过氧化物酶单层试验鉴定(IPMA) 0．15M 0．05M AEC底物溶液，室温作用20．30min；弃去AEC，加入50ktl的pH5．0 洗涤3次；加入501xi 醋酸钠，于光学显微镜观察。 1．10Westernblot 电泳，雨用!卜干法将蛋白带转印到硝纤膜上，用10％脱脂乳封闭过夜；加入待检单抗，室 入化学发光法显色液(PIERCE公司)，进行X光显