猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0612株全长感染性克隆的构建(1)研究.pdfVIP

猪的传染宿 猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0612株全长 感染性克隆的构建 吕健袁世山 (中固农业科学院上海善匡研究所，中圈动物卫生与泷行鹉学中心上海分中心动物传染病防治研究室农 业部动斩寄生虫病重点实齄室上海200232：) 擅要近年采。在垒国范围广泛流行井且引起巨走烃济损失妁“籍无名高热”的主要癌嚣之一为猪警殖与 呼吸综合征病毒(PRRsⅥ．为了便于时PRRSv进行反向连传操作，拳研究根据PRRsv基因组序列设计特异 性引物，分五段扩增，将得到的片段克隆到pBhJcsc—ptIISK(+)截体中，并且利用相关的重叠区酶切位点特 其构建成为全长克隆．在扩增5’瑞时．运用5’乩惦E获得了基因蛆5’t末端序列。在亚克隆八pBIucS州ptII sK(+)并且在5’端上游引入17启动子序列．选取一十克隆在3’端0RF6下游引入MIuI位点．以期作为感染性 分子克隆的筛选标志．最终获得了舍有PRRSvJ)【0612株基因妞全长cDlqA的重组质枉口J)(0612和舍有分子 标志Mlu l的基固组奎长cDNA克隆啦0612，M．转囊MARol45缸胞后得到拯救病毒，而且分子标志稳定存 在．奉研究中构建的基固蛆全长感染性cDN^克隆曲棵寻蔫毒基因蛆蛄构和功能羹定了基础． 猪繁殖与呼吸障碍综合征(Po∞i∞R印哪ductiw锄dRospiralorys”drome，P褂塔)是由 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(P砌峪v)引起的一种高度接触性传染病，俗称“蓝耳病”，该 病以妊娠母猪流产、早产、死胎和木乃伊胎以及仔猪和育肥猪的呼吸道症状为特征。首先发 现于上世纪八十年代美国北卡罗来纳州【l】，于九十年代初相继分离于欧洲【2】和美国【3】，我 国1996年首次发现并分离到PltI峪v。PRRsv在我国猪群中感染率高达85％，该病所致经 济损失难以估量。长江流域诸省猪“无名高熟”的爆发流行。给当地以养猪为主要经济支撑的 农民带来了沉重的打击．国内多位学者研究确定其主要致病病原为Pm强V。近年来，PRJ氇V 致病力似有所增强，表现为PI【l氇v感染怀孕母猪更加严重的流产和高死亡率【4捌。另外一 扩大或改变其靶组织或器官。同时，因PRRSV靶细胞为免疫系统重要成员的肺泡巨噬细胞． 感染猪大多呈现免疫抑制而致继发感染【8，9】。该病毒感染猪多呈现免疫抑制，从而导致混 合及继发感染。PRRsv与马动脉炎病毒㈣小鼠乳酸脱氢酶病毒皿DV)和猴出血热病毒 约15kb，不分节段的单链正股RNA，PI状SV的欧洲型与北美洲型的基因序列差异性很大， 且P附峪v遗传及抗原性差异很大且易发病毒间重组，导致病毒基因组极易发生变异。为了 更好的研究这次无名高热中的PIu塔v的变异特点和分子特性，构建一株我国当前Pm峪v 流行毒株的基因组全长cDNA感染性克隆对有效诊断，并研制有针对性的疫苗，从而提高 当前PⅪ塔v疫苗保护率有着至关重要的作用． 1材料与方法 1．1材料 1．1．1病毒和细胞 Marc-145细胞，PRRsVsp株均由本实验室保存。病毒分离于“无名高热”流行的江西的 发病猪场。 1．1．2质粒与苗株 TIANGENE公司。 1．1-3其他试荆 ViTaI鼢认M．mi QIA锄p Kn购自QIAGD吧公司．QuamRever∞Tr蚰sc嘶悟se·DNA胶 公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司． 1．1．4引物 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 根据Geneb越出中北美株的序列，设计特异性的针对PfLRsV基因组中的相对保守序列 设计引物。由上海桑尼生物技术有限公司合成，引物序列如下： 襄l引物序列 名字1 序列2 位置1 ”” 3IL T1馘 SFl392oCCG00C兀1’0CCCG兀℃GT 1392·14II