猪卵母细胞体外成熟的细胞培养模型的建立研究.pdfVIP

·214· 中国畜牧兽医学会养堵学分会学术讨论会论文集 猪卵母细胞体外成熟的细胞培养模型的建立 傅国栋1，夏国良2 (1．上{每农科院畜牧兽医研究所，上海，201106； 2．中国农业大学生物学院．北京10G094) 搐要：为了模拟活体卵泡环境．对猪卵母细胞体外成熟进行研究，关键是要建立猪卵母细胞的体外成熟培养摸 型：实验通过无血清培养技术，研究了猪卵母细胞体外自发成热和在次黄嘌啉(nX)一猪卵泡液中自然存在的 物质对体外白发成熟的影响。结果表明，猪卵丘一卵母细胞复合体(CEO)和棵卵母细胞(DO)在自发培养基 中能够自发成熟；在自然存在的(Hx)培养液中，可以剂量依赖性的抑制猪卵母细胞体外自发成熟。用cAm， 20 h 产生的激动荆Foakolin处理CEO和DOh，可以报其显著地协同Hx对卵母细胞成热的抑制作用。处理40 CEO中卵丘细胞的存在参与了卵母细胞的成熟，既卵丘细胞可以分泌一种能够克服F衄skolin和I-IX抑制作用的 物质。Forskolin短期预处理可以诱导卵丘细胞分秘这种促进卵母细胞成熟的物质。不同剂量的FSH促进GEO中 卵母细胞克服HX的抑制而成熟，但对DO没有效果。HCG对CEO和D0中GVBD均没有刺激作用：说明在卵母 细臆成熟过程中．是聊作用到卵丘细胞上诱导卵丘细胞分泌某种刺澈卵母细胞成熟的物质，而LH或hCG对 猪卵母细胞体外成熟并不起刺激作用。 关键词：绪卵母细胞；体外培养；成熟谓节 随着哺乳动物体外受精，细胞核移植和外源基因导人等高崖技术的不断深入，人们对成熟卵母细胞 的需求量日益增加。因此通过卵巢卵母细胞体外成熟获取大量成熟卵母细胞而后进行体外受精愈益重 要。猪的卵母细胞，自出生到初情期前，一直停滞在第一次减数分裂的双线期，此期的卵母细胞核称为 生发泡(GV)；到初情期排卵前促性腺激素峰作用下．卵母细胞减数分裂恢复，生发泡破裂(GVBD)。 然而促性腺激素是如何作用的?迄今尚不清楚。有证据表明在卵泡内，卵母细胞受到抑制因素的控制， 胞体外成熟的机理目前尚不完全清楚。目前国际上采用的猪卵母细胞体外成熟培养方法是根据卵母细胞 白发成熟的特性建立起来的，但这种方法并不是生理性的卵母细胞成熟方法，对卵母细胞成熟的质量有 很大影响。因此，研究猪卵母细胞体外成熟的机理，并建立一种模拟卵泡内环境的卵母细胞成熟培养方 法对于提高卵母细胞体外成熟的质量具有的理}仑和应用意义。 本实验旨在利用卵泡中自然存在的卵母细胞成熟抑制物(HX)建立一种生理性的猪卵母细胞体外培养 体系，研究猪卵母细胞一卵丘细胞复合体(CEO)和裸卵母细胞(DO)的成熟状况，并进一步研究猪卵 母细胞体外成熟机制的机制。为今后建立卵母细胞体外成熟的细胞培养模型提供理论依据。 1材料与方法 1．1 材料 KEMISKE 1．OVENS FABRⅡc BALLERUP公司产品。 1．2卵母细胞的分离与培养 h内返回实验室。用上 将屠宰场宰杀的初情期猪卵巢取出保存在含有抗生素的37“C生理盐水中在2 述生理盐水将卵巢清洗3遍后置于M199培养液中(含4mmol／L SA，2mmol／L谷氨酰瞎，100 U／ml青霉素和100ur／ml链霉素)，该培养液定义为Hx一培养液。用尖头手 基金项目：上海农科院青年科技基金资助。 傅国栋等猪卵母细胞体外成熟的细胞培养模型的建立 ·215· 卵母细胞直径的吸卵管反复吹吸CEO去掉外围卵丘细胞即可获得锞卵母细胞(DO)。将收集到的均匀一 h。 ch公司)，每孔25—30个CEO或DO，在38．5℃，5％C02培养箱中培养20～40 1．3卵母细胞成熟的观察 培养结束后将卵母霞胞用固定液(acetic—ethanol 着色观察卵母细胞生发泡破裂(GVBD)和第一极体(PB