猪胚胎干细胞分化实验研讨.pdfVIP

以科学发展现促进科技创新(一) 91 猪胚胎干细胞分化实验研究 况玲1 冯书堂2 牟玉莲2刘岚2 1．新疆农业大学，新疆乌鲁木齐，830052；2．中国农科院畜牧所，北京，100094 摘要 猪原始生殖细艟．(porcineprimordialgermcells，PGcs)具有干细胞的显著特性， 能在体外分化为神经细胞、上皮细胞和胚泡细胞。当悬浮培养时猪EG细胞形成拟胚体，再经 维甲酸(RA)和=甲基亚矾(DMSO)诱导分化类桑椹胚体、类ES样细胞集落、神经样细胞和滋 养层样细胞。 关键词 猪胚胎干细胞分化 雏甲酸 二甲基亚砜 stem 胚胎干细胞(embryoniccell，ES)是一种能在体外增殖，又能保持未分化状态的细胞。在一定条 件诱导下，可向多个方向分化，并生成多种功能性细胞。目前已经从胚胎干细胞分化培育出了心肌细 胞、神经细胞、血管内皮细胞和壁细胞、胰岛细胞等(HubnerK，FuhrmannG。ChristensonL．K．etal， 2003)。EG细胞的定向分化作为种子细胞，较以往用人或动物的组织细胞作种子细胞好，数量大，生长 快，取材容易。目前用实验动物ES细胞作核受体，用自身细胞作为供体，经细胞核移植分离ES细胞， 经定向分化，用作克隆治疗，解央异俸移植的排异问题。对胚胎于细胞的研究具有广阔的应用前景，但 也存在很多问题尚待解决。 一、材料 (一)实验动物 大白猪(中国农科院畜牧所)，胎儿来自自然发情的性成熟的母猪。 (二)主要试剂 DMEM粉(Dutbeeco’sModified 一EDTA混合液(SIGMA)，丝裂酶紊C[Mitomyeine 血清(NBS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)，干细胞生长因子[stemcell 成纤维细胞生长因子[basicfibroblast growth (GIBCO)，p一巯基乙醇，L一谷氨酰胺(GIBCO)，0．1％明胶，维甲酸[Retinolcacid，RA，(SIGMA)]，二甲 基亚砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)。 消化液：0．25％Trypsin一0．1％EDTA。 无Ca”、M92+PBS液：NaCL lOg，Na2HPOs 1．449，KCL0．259，KH2P030．259，加18．20纯净水 到1000mL。 诱导分化培养液：A液：5×10 6RA的EG培养液，B液：5×10 液，C液：05％DMSO的EG培养液。 92 竺竺兰兰垦兰堡兰竺兰竺兰!±! !一： ． 二、方法 (一)胚胎的收集 胎中分离生殖嵴，用无ca2+、M92+PBS反复冲洗几遍。将生殖嵴在玻璃表面皿上研细，用细的吸管吹 germ 干细胞培养基接种在新鲜的滋养层上，原始生殖细胞(primordial 培养箱中培养。 (z-)EG细胞的培养 将收集的PGCs细胞分别接种于前一天制作的新鲜的STO细胞饲养层上培养，第二天观察，换掉 1／3的培养液继续培养。PGCs在培养的第二天就开始有EG细胞积聚出现，到第三天和第四天开始出 现大量的细胞聚集，并开始大量的有EG细胞集落出现，到第七天和第八天EG细胞集落出现达到高 峰，这时可以传代培养，每天需换液一次。 (三)拟胚体的制备 将猪胚胎生殖细胞(embryonicceil，EG)I书EG细胞培养液悬浮或在只涂有明胶的培养皿中培 germ 养，培养3～4d拟胚体形成。 (四)拟胚体的诱导分化 当出现拟胚体(EB)时，将拟胚体分为4组，移人涂有明胶的培养皿中，分别用A诱导液，B诱导液 和C诱导液进行培养。第四组为对照组。每天观察2次，3～4d拟胚体贴壁生长并开始出现分化。 三、结果