猪胚胎生殖细胞的分离培养与鉴定研究.pdfVIP

2004学术年会 猪胚胎生殖细胞的分离培养与鉴定+ 刘岚，冯书堂，牟玉莲 中国农业科学院畜牧研究所，北京100094 摘要：本实验对从原始生殖细胞分离获得胚胎干细胞的方法进行了初步研究，胎儿取自怀孕 +2mmol／L谷氨酰胺+lmmol／L非必需氨基酸+o．1mmollL 霉素+15％FCS作为培养基，经传代获得EG细胞并传至3—4代；获得的细胞集落形态多样，多呈岛 状或巢状，经AKP染色、阶段专一性胚胎抗原表达SSEA一1、转录因子Oct．4的表达等方法的鉴定， 具有胚胎干细胞的诸多特征。 关键词：胚胎生殖细胞原始生殖细胞猪EG细胞的鉴定 胚胎生殖细胞(EG细胞)是从胎儿原始生殖细胞(PGCs)分离培养出来的具有发育全能性或多 能性的干细胞。与来源于早期胚胎内细胞团的ES细胞统称为胚胎干细胞。 近年来，临床同种异体器官移植的成功和供体器官的短缺，使人们试图用动物器官来代替人体 器官作为器官移植的供体。而猪多项生理生化指标与人类相近，与人类具有高度同源性，虽然存在 一些免疫排斥的问题，但综合考虑猪仍不失为异种器官移植的理想供体。而且PGCs材料来源比较 丰富，以猪为例，每头实验动物一次可以提供15000多个PGCs，胚胎千细胞是动物克隆廉价材料， 具有多功能性、高度分化潜能和定向整合能力等：因此，猪的胚胎干细胞研究，对于种质资源保存、 发育调控机理研究、组织工程开发利用及一些疾病的治疗具有重要的理论意义和实用价值。 1材料与方法 1．1实验动物 26—28天的猪胎儿，胎儿来自自然发情、自然多四的母猪。 1．2 EG细胞分离培养的方法 B．巯 养时加10％胎牛血清。 1．2。2饲养屡的制鲁 放入37。C、5％C02培养箱中培养备用。 1．2．3PGCs的分离与原代墙养母猪妊娠26．28天时，屠宰母猪，摘除子宫，无菌条件下，取出包 液洗干净后，仔细去除胎儿的头、尾、四肢及内脏，分离出胎儿的生殖嵴，用无Ca“、M92+PBS液 洗涤数次后，放入表面皿中充分研碎，加入约lml含1％胎牛血清的PBS，将研碎的组织全部移入离 心管中，充分吹打，室温静置，待沉降后吸取上清液；将沉淀中加入含1％胎牛血清的PBS自然沉 ‘本研究由科技部“863”No．2003AA205103资助 ，。。囝 2004学术年会 降，如此反复沉降三次，将三次的上清液收集在一起，离心弃上清，将所得沉淀重悬于培养液中， 接种于预先制备的饲养层上，放入385℃、5％COz培养箱中培养。隔日观察细胞贴壁情况，换去部 分培养液。以后每天换液，观察细胞生长状况。 1．2．4EG细胞的传代 一般7一10天后细胞增殖速度减慢，最开始出现的克隆点己开始分化，需 要做feeder准备传代。传代时将EG细胞集落连同饲养层细胞一起消化制成单细胞悬液，有些大的 细胞团用拨针将其拨开，然后接种于一个新鲜制备的饲养层上。 1．3 EG细胞的鉴定 1．3．1 A AKP染色按照Jorge PH=9 染色液(O．4 0的Tfis—C1 mg／mlⅡ一磷酸萘酯，1mg／ml坚牢红TR，8mmol／LMgCl2，溶于25mM 缓冲液)室温放置约30分钟后，阳性细胞即呈红色；PBS漂洗以终止反应。 殖，此时吸去培养液，加入4％多聚甲醛置于4℃冰箱固定：然后吸去4％多聚甲醛，用0．01MPBS冲 4℃冰箱过夜；取出后放入35℃摇床中孵育；然后用0．01MPBS冲洗；避光加入FITC．二抗(HTc 为标记物)，室温放置；再用0．01MPBS冲洗。抗体均用O．01MPBS作l：100稀释，免疫组织化学 染色用荧光显微镜观察。 1．33转录因子Oct．4的裹达免疫组织化学染色同SSEA-1抗原染色，抗体用o．01MPBS作1：100 稀释。 bodies，EBs)，贴壁后分化成神经细胞、上皮细胞等。 2结果与讨论 2。1 EG细胞的分离培养 国内、外已