猪前脂肪细胞的分离培养及鉴定研究.pdfVIP

578查主墼塾塑塑焦查壁受塞粪星 猪前脂肪细胞的分离培养及鉴定① 杨红文1@刘则学1@高其双2 彭健1 蒋思文2@ (1．华中农业大学动物科技学院，武汉，430070) (2．武汉市畜牧科学研究所，武汉，430065) 摘要：目的：摸索猪前脂肪细胞的原代培养方法，为研究猪脂肪发生的分子机制奠定基础。方法： 取皮下脂肪，酶消化法分离细胞，用转铁蛋白、氢化可的松、胰岛素诱导分化，油红O染色鉴定。结果： 在培养期间，细胞逐渐由梭形变为圆形，并逐渐增大，油红0染色为红色。结论：分离的细胞为未分化 的前脂肪细胞，可用此方法培养的细胞进行脂肪发育过程中具体分子事件的研究。 关键词：猪；前脂肪细胞；细胞培养 肥胖及相关的疾病是当今世界威胁人类健康的主要问题之一，人们希望摄人低体脂和高肌内脂肪 的肉质产品。研究家畜脂肪细胞的分化机制是解决这一难题的必要途径。脂肪组织的增加是由于脂肪 细胞的增殖分化所致，脂肪细胞的分化就是由没有脂滴的前脂肪细胞转化为含有大量三酰甘油的成熟 脂肪细胞，为进一步的研究打下了基础。 1材料和方法 1．1试验材料 1．1．1主要试剂 任公司，都为分析纯试剂。 1．1．2主要试剂的配制 FBS、100U／ml青霉素、lCOpg／ml链霉素，充分溶解后转入容量瓶定容至1 000ml；定容 养液A中加终浓度为lOOnm牛胰岛素、50ng／ml氢化可的松、12pg／ml转铁蛋白，定容后至1 的培养液经调整pH，过滤除菌，分装后于4。c保存。消化液：称取胶原酶100mg，BSA29，加培养液A定 0．82389、 J：称取O．59油 0．10019、0．00379，加五蒸水溶解后定容至100*zd，过滤除菌后于室温保存；油红0工作液_3 析滤纸过滤2遍，室温保存。 1．2方法 1．2．1猪皮下前脂肪细胞的分离 从7—21日龄猪颈、肩、背部无菌采取皮下脂肪组织，放人装有PBS的烧杯中，转入玻璃皿中反复冲 ①资助项目：国家自然科学基金。 ⑦并列第一作者。作者简介：杨红文．男，在读硕士；刘则学，女，在读硕士 cn ③通讯作者：蒋思文，男，教授，博士生导师，E-mail：j岫画w帅@r衄1．t跏．edu 基 丝里579 洗并去除非目标组织，用眼科剪剪碎组织，随即转人50ml的三角瓶中，于37％的恒温振荡水浴锅中振荡 消化60rain，消化完毕，加入培养液A终止消化，吸管吹打，分装入离心管并于1 可见上层漂浮有脂肪细胞，除去这些细胞和培养液，用PBS重悬离一Ii,管底的沉淀，加人红细胞裂解液再 碎片，滤液中的细胞就是基质．血管细胞(s．V细胞)，即前脂肪细胞。 1．2．2。猪前脂肪细胞的原代培养 培养箱中培养，24h后，洗去未贴壁的物质，换用培养液B诱导分化，以后每隔2d换用培养液B。 1．2．3细胞生长曲线的绘制 根据薛庆善_40进行，将悬浮的细胞等量接种至24个培养皿中，随机分成8组，每组3皿，每天取出1 组进行汁数，取其平均值，绘制生长曲线。 1．2．4油红O染色。51 自来水洗数次直至漂浮物完全干净，显微镜下观察。 2结果 2．1细胞形态和特征 细胞接种24h后几乎全部贴壁，呈成纤维细胞样的纺锤形。3d时有少量细胞开始聚集脂滴，聚集脂 滴的细胞趋于圆形，此后，聚集脂滴的细胞数量逐渐增加，体积增大，7d时，可见很明显的较多的圆形细 胞，有的体积很大，并有少部分从瓶底漂浮起来。(图1，A，B)。 2．2细胞生长曲线 猪前脂肪细胞接种后，第1～2d生长缓慢，第3d生长开始加快，进入对数生长期，持续3d左右后进 人平台期，第7d，细胞开始脱落死亡。(图2)。