猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株ORF5基因的克隆及在293T细胞中表达研究.pdfVIP

猪的传染病 2．2病毒鉴定 取第二代培养上清，制备RNA，以PRRsVN蛋白基因通用型检测引物进行RT．PCR． 结果都扩增到约300 bp大小的唯一条带(图略)。同时，以第二代培养上清感染MARC．145 细胞单层．3天后崮定，用针对PRRsvN蛋白的特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光检测， 感染细胞的胞浆内都呈现出特异性黄绿色荧光。而对照细胞无特异性荧光(图略)。 2．3Nsp2基因变异的初步检测 取第二代培养上清，制备l讣n，以猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp21594．1680变异株) RT-PCR检测试剂盒扩增Nsp2的部分编码区，结果与阳性对照～样，都扩增到400bp大小 的唯一条带(图略)。显示Nsp2编码区存在缺失。 2．4猪瘟病毒检测 无论是用EusA还是荧光RT-PcR都没有检测到猪瘟病毒。 3讨论 我们将来自不同地区的高热综合征发病猪场的病辩接种MARc．】45细胞后，分离到6 株病毒，经N蛋白基因的RT_PCR和间接免疫荧光试验鉴定为Pf艰SV。经调查，这6个养 殖场(户)从未使用过任何猪繁殖与呼吸综合征疫苗。另外，我们从相距很远的6个发病猪 场都分离到PRRsv，而且都有Nsp2的缺失，这与其他单位的研究结果一致活i果提示PIu峪v 在这几次高热综合征疫情中具有重要的作用，至少也是重要的共感染病原因子之一。PRRSv 分离株在这几次疫情中的具体作用及其对猪的致病性还需要通过动物试验来确定。 从这6个猪场病猪的解剖情况来看，除了呼吸系统和淋巴结的病变以外。还有其它一些 病理变化是以前PRRS所不具有的，如肾脏、心耳以及膀胱黏膜出血点或出血斑，脾梗死灶， 胃和盲肠黏膜溃疡灶等。相反，这些变化具有猪瘟的特征。但是，无论是从病料还是细胞培 养物，用猪瘟病毒抗原检测ELIsA和荧光RT-PcR都没有检测到CSFV。这里面是否还有其 它病原的作用值得进一步研究。如果这些都仅是由PRRSV所致，那么我们对PRRSv的致 瘸性将有一个全新的认识。 我们所分离到的6个毒洙聪传代细胞MARC．145的适应性很强．在第一代和第二代就 出现了明显的cPE。而以前的一些毒株对传代细胞的适应能力比较差。如国内分离株 分析表明HB-1(sh此002在适应传代细胞后。其Nsp2及囊摸相关蛋白等基因都发生变异。 我们正在进行6个分离株的全序列测定，以明确除了Nsp2部分缺失以外，基因是否还存在 其它显著的变异。 总之，我们从自己接触的所有高热综台征发病猪场都分离到具有共同特征的PRRsv， 表明PRRsv Nsp2特征性变异毒株至少是高热综合征的主要病原之一。该病毒的生物学特 征、致病和免疫机制、毒力的分子基础等急需进行深入研究。 参考文献略 猪繁殖与呼吸综台征病毒河南分离株ORF5基因的 克隆及在293T细胞中表达5 党占国。．夏平安h。崔保安‘，张红荚1．尹彦涛‘，王建举。．柴春霞1，陈溥言z (1．河南农业大学，郑州．450002；2．南京农业走擘。南京，210095J 罐盒项目：中国博士后基金项目(20060390944) 作者简介：党占国．男，河南驻马店人。嘎士研究生．从事动物疫病分子病原学及分子免疫学研究· 通讯作 者： E·啪“：xp4-88@sobu+com 218 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会 特异性引物，应用RT-PcR方法扩增PRRsvHn脑1分离株0RF5基因片段．将扩增片段克隆到真核表达栽体 w白em．b10t检测，证明0RF5蛋白在293T细胞中获得了表达，可与PRRsv阳性血清发生特异性反应． 谊研究结果将为进一步构建PRRsv假型病毒，研究PRRsv进八细胞的发病机制奠定基础． 关键词PRRsv；oRF5基因；克隆；真棱表达 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PI讯Sv)引起的～种以怀孕 母猪的繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状为特征的传染病。该病首先暴发于美国，随后传播到 世界各地，给世界养猪业造成巨大的经济损失。PRRS现已成为危害我国养猪业发展的重要疫 病之一。PRRs流行病学非常复杂，PI氓sv急性感染后可引起长期的持续性感染，猪场一旦 污染该病后很难净化。目前，临床上主要使用PRRsv灭活苗或弱毒苗进行免疫预防，但实 践证明．弱毒苗本身存在散毒危险【l’2J．而灭活