猪囊胚在饲养层上的生长行为研究.pdfVIP

猪囊胚在饲养层上的生长行为* 冯秀亮 雷安民杨春荣 高志敏安立龙 杨 奇 窦忠英 西北农林科技大学家畜生殖内分泌与胚胎工程农业部重点开放实验室 【摘要】 采用昆明品系小鼠胎儿成纤维细胞(PⅧF)饲养层，培养7—9日龄猪孵化 囊胚，对其生长行为进行研究。结果显示：1)猪7—8日龄孵化囊胚贴壁之前形态发 生变化，不易区分滋养层细胞和ICM，贴壁后细胞增殖范围局限，未见滋养层细胞充 分铺展，形成的ICM为小且扁平混合型集落，AKP染色呈弱阳性；2)猪9日龄孵化 h之内贴 囊胚置于饲养层上4h之后囊腔塌陷，周围滋养层细胞发生折叠，于36—72 壁，贴壁后先是滋养层细胞在饲养层表面生长扩展，然后ICM开始呈平面增殖生长。 培养4d后形成稍隆起的团状或条状ICM，AKP染色阳性，7d后AKP染色呈弱阳 性。3)猪9日龄胚直径对贴壁时问、贴壁率存在影响。对直径较大胚胎进行切割除 去部分滋养层细胞培养贴壁时间提前，贴壁率和ICM克隆率提高。 【关键词】猪囊胚饲养层生长行为 oniestem cells，Es细胞)，由于其潜在的科研及应用价值，吸引了大量学者对其进行分离研究。 采用与分离小鼠ES细胞相似的方法，他们分别在猪、牛、绵羊、山羊、仓鼠、水貂、兔及人等多 种动物取得很大进展。尽管如此，文献关于胚胎在饲养层上的生长行为报道相对较少，而这一 点是胚胎干细胞分离中选择最佳ICM集落生长状态和最佳传代时间的一个关键环节。 本实验中基本采用与小鼠胚胎培养相似的培养基，将7—9日龄猪孵化囊胚置于小鼠原代 胎儿成纤维细胞(primaryembryonic 增殖速度、生长状态等进行研究，以期确定ICM最佳集落形态和最适传代时间，为进一步的 ES细胞分离提供参数。 1材料和方法 1．1试剂来源及溶液配制 无Ca2+，M孑+PBS液国产药品自配。配方及配制方法见Robertson报道。 PMEF培养基 高糖DⅧM(Gib∞)，添加10％犊牛血清(自制)，0．1mM2一巯基乙醇 (Gibeo)，0．1 mM谷氨酰胺(Giboo)和0．1川NaSeOs(IN产)o 胚胎培养基含15％犊牛血清的PMEF培养基中添加20 ttg／mlIGF—t(Sigma)。 ’农业部生物技术项目(攻关)，85—11一02—1 ·———203·-—— 冲胚液含1％犊牛血清的无Ca2+，M孑+PBS液。 细胞消化液 0．22肛m孑L径滤膜过滤、分装，一20℃冻存备用。 丝裂霉素C液丝裂霉素C(Sigrna)，配制方法见Robertson报道。 1．2 PMEF的分离与饲养层制备 选择妊娠9—15 1．3猪胚胎获取 选8—24月龄关中黑猪和长白杂种猪，将自然发情母猪与公猪自然交配3—5次(每次间 d手术法子宫冲胚。 隔10—12h)，交配当日为0d，交配后7—9 1．4胚胎培养 吸去前一日预先制备的饲养层中的培养液，加入等量胚胎培养液。将猪胚置于饲养层上， 每孔一枚。最后将四孔板置于c02培养箱中培养(38．512，5％coz，饱和湿度)。 1．5磷性磷酸酶(AKP)染色 方法见严云勤等报道。 2结果 2．1不同日龄孵化囊胚贴壁过程的差异 猪7日龄和8日龄孵化囊胚(图1)在置于饲养层上4h之内发生皱缩，细胞颜色加深，滋 养层细胞和ICM不易区分而成为松散的团状(图2)。随培养时间延长，边缘可见体积增大的 h之后逐渐出现由单个细胞分化形成的简单胚体样结构，之后此结构与 清晰的单个细胞，10 其周围的细胞成块状脱落(图3)，在脱落过程中细胞团主体部分逐渐贴壁(图4)，时间在48— 72h之间，其中7日龄胚大部分崩解脱落成小细胞块(16／17，94．1％)。 freshhatched 图28日