猪卵母细胞去核方法的改进研究.pdfVIP

第-1二届全国动物繁殖学jI。讨论会论文集 猪卵母细胞去核方法的改进” 刘东“2汤琳琳“2张德福“2一陈晓宇3 (1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106； 2上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海201106 3西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌712100) 摘要：猪的体细胞核移植研究在生物医学领域具有重大意义。本试验对克隆技术中关键步骤之 一的去核方法作j较深入的研究。试验结果表明，由本实验室改进的Willadsen去核法——二步挤压 5％、674％，005)。同时，本试验还发现，卵母细胞成熟培养36h后去核组去核效率(89． 去核法(42 1％)显著地高于成熟培养44h后去核细-(55．8％，0．05)。 关键词：猪；卵母细胞；去核；核移植 自“多利”羊问世以来，体细胞克隆研究已取 华孚新生物技术公司)、hcG(宁波激素制品厂)； 得了很大的发展，相继获得了牛、山羊、鼠等克隆 动物。相对而言，猪的体细胞克隆研究进展较 慢，所以直至2000年才有所突破，获得体细胞克 c02、95％空气及饱和湿度下培养36M4h。培养 隆后代。但猪体细胞核移植重构胚的体外发育 结束后，将成熟的卵母细胞放在含lmg／ml的透 率仍相当低。值得进一步探索研究(张德福等， 明质酸酶的NMl99液滴中，在培养箱孵育 2000)。影响核移植效率的因素颇多，卵母细胞5min．用口径略大于卵母细胞的吸卵管反复吹吸 的去核是其关键因素之一，本研究试图对此作进 除去卵丘细胞。将排出第一极体或一侧卵周隙 一步的探讨。 扩大的卵母细胞移到含5pg／ml细胞松弛素B的 从屠宰场运回猪卵巢，在体视显微镜下检取 NMl99液滴中，37℃温育15rain，再移至凹玻片 可用的C()Cs(卵丘一卵母细胞复合体)。将检出上已覆盖矿物油的NMl99液滴中，然后将凹玻 的COCs在NMl99(即含10％体积NCS的片放在显微操作系统的载物台上。 先用固定管固定卵母细胞，使第一极体(或 Mediuml99．美国Biowhittaker公司)液滴中清 洗3次后，迅速转入上覆矿物油并已平衡2h的 卵周隙扩大的一侧)位于固定管的对侧(时钟的 成熟培养液中。成熟培养液为添加了10％ 3点处)。再将去核管刺穿透明带，使之进入卵 PMSG(天津市周隙内，稍微拉回去核管，使其尖端后退到透明 NCS、pFF(v／v．自制)；lOIU／ml 。本研究由德国BMBF(编号No：CHN99／310)金； 014909005)资助。 上海市科学技术委员会基金资助课题(No 一通讯作者．E—marl：zhangdefu@hotmal!corn。 一12 第-I-二届全园动物繁殖学求讨论会论文集 带下，将极俸连同其下的部分胞质吸入去核管 方或下方，直接用钝端去核管在透明带切口的斜 中，此时可见质膜呈弧形开始凹入去核管．当凹 、F方推挤卵母细胞。使第一极体连同其附近的 入的弧形胞质达到卵胞质的114113时。慢慢将114113胞质溢出透明带．然后用钝端去核管吸 去核管连同其内容物拉出透明带，并释放卵母细 除溢出透明带的第一极体及连同其附近的胞质 胞(McGrath—Solter去核法，M—S去核法)。 (Willadsen去核法的改进法一二步挤压去核 或使第一极体(或卵周隙扩大的一侧)位于 法，见图l、2)。 固定管的上方或下方(即时钟的12点或6点 去核操作过程中吸入过多胞质．或使卵母细 处)。将玻璃针在第一极体两侧(或卵周隙扩大 胞质膜破裂、胞质外流的，计为操作失败。 的部分)115114卵周长处，沿第一极体(或卵周将去核后的卵母细胞