猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ表达蛋白单克隆抗体的制备研究.pdfVIP

猪的传染病 用简单的超声波裂解和离心方法获得初步纯化的重组蛋白。westemblot实验表明，表达的 重组蛋白能被№。抗体识别，也能与多克隆抗体特异性的结合，表明表达的蛋白都保留了各 自的抗原性，也具有免疫原性。将纯化后的蛋白免疫小鼠后能够抵抗1MLD大肠杆菌强毒 生仔猪大肠杆菌性腹泻基因工程疫苗的候选株． 参考文献略 猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ表达蛋白单克隆抗体的制备27 袁秀芳，王一成·，徐丽华 浙江省农科院畜牧兽医研究所，杭州，浙江．3l002l 摘要：特APPapxrv N端基因克隆于pET≈8a栽体中，转化大腑杆茵，并进行诱导表达．收获融合表达的 印xIv蛋白，按50¨g，只的卉4量与等量弗氏佐剂乳化后。经腹腔接种BALB，c小鼠，免疫3次后．取其脾细胞 与sP2／0骨髓瘤细胞进行融合．用婶xⅣ表达蛋白作为包被抗原，通过间接ELlsA方法筛选阳性克隆．结果获 得了3株能稳定分泌抗aDxIv蛋白抗体的杂交瘤细胞株。审名为4H3。lDll和4cI．亚型鉴定结果显示，3株 单克隆抗体为IgGl型．经west锄bl叶分析证实，3株杂交瘤细胞上清液能与apxIv表迭蛋白特异反应．研究 获得的融夸蛋白单克隆抗体为今后建立谊菌的免疫胶体金诊断技术．分析apxⅣ蛋白的抗原表住等提供有益 帮助． 关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌：单克隆抗体；杂交瘤株；apxⅣ 菌属，它可感染各个年龄段的猪引起猪接触传染性胸膜肺炎(Porc{neconta百ous 并且各个国家流行的优势血清型各不相同。不同血清型之间及同一血清型的不同菌株的毒力 均存在差异，致病性也有强弱之分。从而导致该病的诊断和治疗非常困难。 近几年来的研究表明，与病原菌毒力相关的因子有毒素、荚膜、外膜蛋白、脲酶等，其 中毒素既是主要的毒力园子，也是主要的免疫原。可作为诊断抗原建立血清学检测方法，还 可以用于诊断和衡量免疫状态，因此毒素研究已成为该病的研究热点。胸膜肺炎放线杆菌共 有4种毒素(A“nob∞illIls 发现的毒素Ⅳ，它们均属于RTx∞peatsint}le 对其中任何一种毒素的检测结果都无法确定其血清型，并且各血清型间没有交叉免疫反应。 J。因此， ApxⅣ毒素蛋白任何血清型都能在体内分泌，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素9 毒素Iv蛋白在研制新型疫苗和建立诊断方法等方面具有潜在的理论价值和应用前景。本文 旨在建立血清2型猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅣ的单克隆抗体杂交瘤株，为今后建立该菌的分 型诊断技术奠定基础。 1材料与方法 1．1细胞株及小鼠 小鼠骨髓瘤细胞sP加由本室保存；纯化的apxⅣ由本室制各保存；弗氏佐剂、融合剂 购于G舭。公司。标准胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。4周龄BALB／c小鼠， 由杭州实验动物中心提供；二氨基联苯二胺(DAB)为华美生物公司产品：TMB为上海生工产 品；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购自鼎国生物技术公司；其它试剂均为国产分析纯。 ”基金项目：浙江省科技计划重点项目(2004c220“) ‘通讯作者：王一成，淅江人．研究员．Em棚：xn瞄b《}za岱．org 中国畜牧兽医学会动物传染府学分会第十二次学术研讨会 1．1抗APPapIⅣ单克隆抗体的制备 1．1．1小鼠的免疫 取表达纯化的融合蛋白按每只50聘的剂量与等量弗氏完全佐荆进行乳化，经皮下多点注 射免疫6～8周龄BALB／c小鼠，以后每间隔2周再用弗氏不完全佐剂乳化的融合蛋白加强免疫 2次，于融合前第3d经腹腔加强免疫1次，每只200峙的剂量。 1．1．2细胞融合 融合前取正常小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，于37℃c02培养箱中培养24h，然后 取免疫小鼠的脾细胞与SP加细胞以l：lO的比例在融合剂PEGl450的作用下进行细胞融合。融 合过程按文献【7】的方法进行．细胞融合后加入选择培养基HAT，于37℃C02培养箱选择培 养约7～10d，当有融合细胞出现时，更换HT培养基继续培养。 1．1．3阳性杂交癯细胞株的缔选 当融合细胞达到孔底的1，10时，采用ELISA间接法检测融合细胞上清中的特异性抗体， 以sP2，o细胞上清作为阴性对照，免疫APPapxⅣ蛋白的BAu}／c小鼠血清作为阳性对照，筛 选阳性细胞株。 1．1．4阳性杂交瘤细胞株的克隆化