第十章_微生物与基因工程-2.ppt

微生物与基因工程 基因工程概述; 基因的分离、合成和定位诱变； 重组DNA分子的构建； 重组子的扩增及筛选 外源基因在细菌中的表达； 基因工程的应用 1. 基因工程概述 把分离到的或合成的基因经过改造, 插入载体中; 重组子导入宿主细胞内，使其扩增和表达; 最终得到大量基因产物，或令生物表现出新的形状。 1.2 基因工程大事记 1973 Cohen和Boyer第一次将重组体DNA转化大肠杆菌，实现了DNA的分子克隆; 1978 Genentech公司---人胰岛素---世界上第一种基因工程蛋白药物 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所-克隆羊多莉 1999.9 中国获准加入人类基因组计划, 负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 1.3、基因工程基本过程 微生物与基因工程的关系 基因资源： 基因工程载体 基因工程工具酶； 基因工程宿主 基因工程的生物反应器； 基因工程理论研究 2 目的基因的获得 从基因文库或cDNA文库中分离目的基因 基因的化学合成 PCR扩增基因 基因的定位诱变 2.1 从基因文库或cDNA文库中分离目的基因 一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息（即全部DNA序列）。 cDNA文库 细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多（大约15%），因而，mRNA逆转录为cDNA所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。 从基因文库或cDNA文库中分离目的基因 根据目的基因序列，可利用标记的基因探针、限制性内切酶、聚合酶链式反应（PCR）等方法从文库中筛选出目的基因。 如果筛选的是表达文库，可以通过检测基因产物来筛选。 2.2　基因的化学合成 目前化学合成寡核苷酸片段的长度约为 150~200 个核苷酸左右。 2.3 PCR 扩增基因 聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction, PCR DNA 片段两端的序列已知，先合成一对寡聚核苷酸引物，它们各自与所需扩增的 DNA 片段的末端互补。 PCR 由 3 个基本反应组成： 2.4 基因的定位诱变 3.1克隆载体 指负责将外源基因运送到宿主细胞中并进行复制与扩增的运载工具。 目前克隆载体种类 细菌质粒载体 λ噬菌体载体与黏粒载体 柯斯质粒载体 M13噬菌体载体与噬菌质粒载体 真核生物克隆载体及人工染色体。 pBR322质粒载体的结构特征 环状双链DNA分子，由4361bp组成; colEⅠ复制起点，外源DNA大小为5kb左右; 四环素抗性基因（Tetr）、氨苄青霉素抗性基因（Ampr）; 24单一酶切位点（ Tetr中7个， Ampr中3个）。 3.2　基因工程工具酶 常用工具酶种类 限制性内切酶 把DNA长链切割为短的片段 DNA连接酶 将两段DNA片段拼接起来 3.2.1 限制性内切酶 是指能识别双链DNA分子中的特定序列，并在识别位点中或其附近切割DNA的一类内切酶。 II型限制性内切酶的切割方式 形成粘性末端（cohesive end）; 形成平末端（blunt end）; 3.2.2 DNA连接酶 催化在两条DNA链的末端形成磷酸二酯键，包括粘性末端碱基配对的两条DNA链和末端都是平末端的两条DNA链 3.3 外源基因与载体的体外连接 重组DNA分子的构建：在分别获得外源基因和合适的载体后，在体外将基因与载体进行连接，构建成为一个能在宿主细胞中自主复制的DNA分子。 黏性末端连接法 4 重组子的扩增与筛选 4.2 重组体的筛选与鉴定 载体选择标记的鉴定 目的基因序列的鉴定 外源基因表达产物筛选 4.2.1 载体选择标记的鉴定 (1) 抗生素抗性选择法 (2) 插入失活法 (3) β-半乳糖苷酶显色反应法 (2) 插入失活法 因外源 DNA 的插入而导致基因失活的现象，称为插入失活（ insertional inactivation ） 4.2.2 目的基因序列的鉴定 菌落（或噬菌斑）原位杂交 内切酶图谱鉴定 DNA序列测定 DNA 序列测定 最后为了确证目的基因序列的正确性，必须对重组体的 DNA 进行序列测定 ; 4.2.3 基因表达产物的鉴定 免疫活性测定 生物活性测定 氨基酸序列