酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定.ppt

酶促反应动力学实验 影响酶促反应速度的因素 酶浓度对反应速度的影响 温度对反应速度的影响 一方面是温度升高,酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 在最适温度条件下,反应速度最大。 pH 对反应速度的影响 在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适 pH。 激活剂对反应速度的影响 抑制剂对反应速度的影响 可逆性抑制作用 研究前提 米氏常数Km的意义 不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。 Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。 Km值表示酶与底物之间的亲和程度：Km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 Vmax 定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。 米氏常数的求法 双倒数作图法 底物浓度对酶活性的影响 ——碱性磷酸酶Km值的测定 ??? 米氏常数是酶促反应动力学中的一个相当重要的常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出Km的方法。 试剂 1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液 ??? 在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成EIS，I竞争结合酶活性中心，其动力学特征是：米氏常数的表观值Km增加，酶的最大反应速度Vm不变。。? 在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形成EIS， I结合酶活性中心以外部位，不影响E与S之间的结合，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm降低而Km不变。 ??? 在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成EIS，其动力学特征是；Km和Vm都降低。 上述三种抑制类型，可在抑制剂存在下通过动力学特征图形判断 酶促反应速度 C F D E A 底物浓度 酶浓度 pH值 抑制剂 激活剂 B 温度 正比例关系 底物浓度>酶浓度 酶被底物饱和 必需激活剂，大多为金属离子，Mg2＋，K＋，Mn2＋，等 酶的激活剂 非必需激活剂 抑制剂通常以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶活性降低或消失。 抑制剂通常以共价键与酶活性中心或活性中心以外的必需基团相结合，使酶失活。 不可逆性抑制作用 可逆性抑制作用 竞争性 非竞争性 反竞争性 Km, Vmax降低 竞争性 非竞争性 反竞争性 Vmax降低 竞争性 非竞争性 反竞争性 Km增大 底物浓度对酶促反应速度的影响 底物浓度的增高 高 低 反应速度和底物浓度成正比关系 酶活性中心被底物饱和 反应速度增幅下降 单底物、单产物反应 酶促反应速率一般在规定反应条件下，用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示。 反应速率取其初速率，即底物的消耗量很小(≤5%)时的反应速率。 底物浓度远远大于酶浓度。 矩形双曲线 Km 即为米氏常数， Vmax为最大反应速度 当反应速度等于最大速度一半时,即V = 1/2 Vmax, Km = [S] 上式表示,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。 因此,米氏常数的单位为mol/L。 米－曼氏方程式 意义：Vmax=K3 [E] 如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算 酶的转换数(turnover number)，即动力学常数K3。 1 V = Km Vmax × [S] 1 1 + Vmax V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度 [S]表示底物浓度 Km表示米氏常数 实验原理 磷酸苯二钠 碱性磷酸酶 H2O pH=10.0，37℃ 酚 Na2HPO4 酚试剂 （磷钼钨酸） OH－ 蓝色化合物 650nm 吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。 混匀后，370C水浴 15 min（准确计时） 混匀后，370C水浴 5 min 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 10％ Na2CO3 0.1 - - - - - - - 碱性磷酸酶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 酚试剂 - 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 碱性磷酸酶液 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 碱性缓冲液 - - 0.2 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 蒸馏水 1.0 1.0 0.8 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 2.5mM磷酸苯二钠 8 7 6 5 4 3 2 1 试剂(ml) 操作 取8支试管，按下表加入试剂。