限制性核酸内切酶EcoRⅠ对质粒DNA的切割.doc

限制性核酸内切酶EcoRⅠ对质粒DNA的切割 EcoRⅠ对重组质粒pUC19-P35S:ARF8切割 潘晓婷 0820010046 广州大学生命科学学院学院08级 摘 要 本实验采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ对重组质粒pUC19-P35S:ARF8进行限制性酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果为图1中第10栏的条带，质粒DNA酶切后产生6个片段，大小分别为289bp；450bp；612bp；873bp；1363bp；2613bp。 关键词 限制性核酸内切酶 EcoRⅠ 质粒DNA 切割 琼脂糖凝胶电泳 前言 限制性核酸内切酶存在于细菌细胞中，起防御噬菌体感染的作用。由于它们对DNA 的剪切作用，因此内切酶可作为分子生物学研究者的“剪刀”广泛应用于基因操作中。根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type Ⅰ）、第二型（Type Ⅱ）及第三型（Type Ⅲ）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。Ⅲ型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。 叶绍辉,彭和禄,王文等关海红,石连玉,刘明华等戴建华,殷文莉袁思霓,张碧乾采用Tru 9Ⅰ/EcoRⅠ和TaqⅠ/PstⅠ两种限制性内切酶酶切组合对细鳞鱼的遗传多样性进行研究王荻,徐革锋,刘洋等 本实验采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ对重组质粒pUC19-P35S:ARF8进行限制性酶切研究其应用。 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验材料 重组质粒pUC19-P35S:ARF8 限制性内切酶：EcoRⅠ、 琼脂糖 1.1.2 实验设备 水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液枪，微波炉，凝胶成像系统等。 1.1.3 实验试剂 5×TBE电泳缓冲液 6×电泳载样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）μg 和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可影微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 混匀反应体系后，将eppendorf管置于PCR仪，设置温度37℃，保温2小时，使酶切反应完全。 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应。 1.2.2 琼脂糖凝胶的制备 1. 取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。 2. 胶液的制备： 称取0.4琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部溶化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液，加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。 3. 胶板的制备： 将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏（宽约1cm）μg /ml。 用移液枪吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固部均匀，速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拔出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后想槽内加入0.5×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽总，所以要注意包装样品槽中应注满缓冲液。 1.2.3 电泳分离DNA片段 1.加样：取10μl 酶解液与2μl 6×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止相互污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 2.电泳：加完样后，合上电泳槽盖立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。 1.2.4 观察和拍照 在波长254nm的长波长紫外灯观察电泳胶板并拍照。 2. 结果与分析 2.1 结果 图1：EcoRⅠ对质粒DNA切割电泳结果 栏1~24：质粒DNA（EcoRⅠ或SphⅠ酶切），栏10：我的结果（EcoRⅠ酶切） 栏25：DNA Marker 2.2 分析 图1EcoRⅠ对质粒DNA单酶切片段的琼脂糖凝胶电泳图谱中，可看出4条较为整齐清晰的条带，通过与DNA Marker进行比对，判断其片段大小由上至下分别为2613bp；1363bp；873bp；612bp，而理论上EcoR I在质粒DN