诱变物质的微核试验.docVIP

本科学生综合性实验报告 学号 ******** 姓名 ******* 学院 生命科学学院 专业、班级 11应用生物教育A班 实验课程名称 实验十一 诱变物质的微核试验 教师及职称 李云海（副教授） 开课学期 2012 至 2013 学年 下 学期 填报时间 2013 年 05 月 25 日 云南师范大学教务处编印 实验设计方案 实验序号 实验十一 实验名称 诱变物质的微核试验 实验时间 2013/05/20 实验室 睿智3栋224 1．实验目的 1）、了解微核发生的机制； 2）、掌握微核实验的一般程序和实践意义； 3）、掌握对实验动物进行药物处理的一般程序、方法和注意事项； 4）、掌握进行实验设计的一般程序和规则，学会用生物统计学方法对实验结果进行统计分析，并锻炼实践能力。 2． 实验原理、实验流程或装置示意图 （1）、实验原理 微核（Micronucleus，MN）：当染色体受到损伤后，染色单体或染色体的无着丝粒断片，或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然游离在细胞质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称为微核。 微核试验（Micronucleus test，MNT） ：凡能使染色体发生断裂或使染色体和纺锤体联结有损伤的化学物，都可用微核试验来检测。各种类型的骨髓细胞都可形成微核，但有核细胞的胞质少，微核与正常核叶及核的突起物难以鉴别。所以多用无主核的细胞来进行微核试验。 嗜多染红细胞（polychromatic erythrocyte，PCE）： 是分裂后期，处于幼年红细胞向成熟红细胞发展中间阶段的一群红细胞。此时的红细胞主核已排出，但因胞质内含有核糖体，用姬姆萨染色呈灰蓝色；成熟红细胞的核糖体已消失，则被染成橘红色；而幼红细胞则有较大的核，且被染成紫红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足，微核被染成紫红色或蓝紫色，很容易辨认，而且微核自发率低。因此，骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。 （2）、实验流程 购买小白鼠（体重为25g-35g，最好雌雄各半） 设置受试组和对照组并对小鼠进行腹腔注射 断颈制取骨髓 离心并涂片 固定后保存 Giemsa染色后冲洗封片并观察、计数。 1）、实验前24h对实验动物（小鼠）进行处理： 腹腔或腹部皮下注射受试药物，阳性物对照（环磷酰胺，剂量可为40mg//kg体重或150mg/kg）和阳性对照物（氟化钠（NaF）剂量为30mg/kg），共注射15只小老鼠。 2）、实验方法： 骨髓的制取 涂片 固定 染色 封片 观察与计数 3）、数据处理： 微核率：1000个嗜多染红细胞中含有微核的细胞数，微核率一般以“千分率” （‰）表示。 以列表方式报告受试物对动物骨髓细胞微核发生率。 4）、实验结果分析 3．实验设备及材料 （1）仪器和器械： 离心机、生物显微镜、解剖剪刀、镊子、注射器、尖底刻度离心管、载玻片、盖玻片、树胶、塑料吸瓶、吸水纸及对苯二酚、秋水仙素、氯化、环磷酰胺、蒸馏水等。 （2）试剂及配制 ①小牛血清（灭活） 将滤菌的小牛血清置于56℃恒温水浴保温30min灭活。灭活的小牛血清通常保存于冰箱冷冻室里。 ②姬姆萨（Giemsa）染液（原液） 成分：Giemsa染料 3.8g、 甲醇 375mL、 甘油 125mL。 配制：将染料和少量甲醇于乳钵里仔细研磨，再加入甲醇至375mL和125mL甘油，混合均匀，放置37℃恒温箱中保温48h。保温期间，振摇数次，促使染料充分溶解，取出后过滤，两周后使用。 ③0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8） 成分：磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 71.64g/L（A液） 磷酸二氢钠（NaH2PO4 ·2H2O） 31.21g/L（B液） 分别加蒸馏水1000mL配成A、B液；取A液51ml,B液49ml混合，再加入100ml蒸馏水混匀，即为pH6.8的0.1