结直肠癌病人的lncRNA筛选以及功能和机制研究方案 邦菲.docxVIP

结直肠癌病人的lncRNA筛选以及功能和机制研究方案研究目的正常结肠粘膜到结肠癌的演化四个阶段（正常—息肉—腺瘤—癌）1. 找出结直肠癌疾病样本四个阶段多组的差异的LncRNA和mRNA.2．找出结直肠癌演化过程中起关键作用的LncRNA和mRNA；验证关键lncRNA和mRNA的功能；（着重侵袭，转移，增殖方面的功能）3. 寻找lncRNA行使功能背后的分子机制；4. 寻找LncRNA与mRNA的调控网络，找到其调控的靶向调节点（比如同一个效应基因或者相同的Pathway，比如mTOR或者MAPK通路。背景介绍及样本准备正常结肠粘膜到结肠癌的演化四个阶段（正常—息肉—腺瘤—癌）结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一。从正常结肠粘膜上皮细胞到结肠癌细胞的演变是多步骤、多基因突变表达、激活的结果，找出结直肠癌演化过程中的关键LncRNA。选取保存的新鲜的冰冻样本或者细胞系样本进行lncRNA芯片以及mRNA检测，并开展后续生物信息分析、功能验证实验，揭示lncRNA和mRNA在结直肠癌演化中的调节作用。研究过程及方法筛选结直肠癌中的关键lncRNA和mRNA，并验证功能芯片实验样本选取及检测选取3对结直肠癌的组织样本（4组12个样本），检测mRNA表达、lncRNA表达、可变剪切以及的表达现象。芯片选择Affymetrix Human Transcipt Array 2.0，可检测3.5万个编码基因，4万个lncRNA，33万种可变剪切产物（来源于31.5万个外显子及26万个外显子连接部位的组合）。芯片实验流程样本RNA抽提样本RNA质量检测（要求260/280比值在1.8-2.1之间，18s和28s条带完整清晰，Total RNA1ug）cDNA合成；正义链cDNA片段化生物素标记芯片杂交芯片洗脱芯片扫描检测信号值过滤去除低于背景的弱信号值试剂及仪器试剂GeneChip WT Terminal Labeling and Controls KitAmbion WT Expression KitGeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit仪器GeneChip Fluidics Station 450GeneChip Hybridization Oven 645GeneChip Scanner 3000 7G生物信息分析差异筛选1. 获得在结直肠癌病人样本间差异表达的基因、差异表达的lncRNA以及差异mRNA2. 分析方法—随机方差模型应用于小样本差异筛选由于实验条件限制，每组样本中重复随机样本数量较少，一般难以达到标准正态分布的参数F检验，为了减少小样本造成的差异筛选误差，利用小样本统计学习和随机抽样的二次检验，计算样本间差异的显著性水平（P-value）和误判率（FDR），得出真正代表多组样本间显著性差异基因。使用本方法较F-test更有效提高了特征筛选的准确性，大大降低假阳性率。说明： + 适用于筛选多组样本间差异基因+ 基因在两类样本间差异标准：显著性P-value0.05且误判率FDR0.05认定为为准确的差异表达基因聚类图看样本和差异Lnc的聚类情况，看哪些Lnc和差异基因可以将结直肠癌演化过程可以阶段性进行分开。2.基因表达趋势分析——STC为了研究样本在 正常—息肉—腺瘤—癌 这样的逻辑顺序下的影响，需要对样本的差异基因进行基因表达趋势分析，应用模糊聚类等机器学习方法，对差异基因进行基因表达趋势的显著性分析，筛选出随着浓度梯度变化过程中基因的表达趋势，得到相应的主流表达趋势，其所属基因的表达变化是与处理浓度梯度变化具有显著性联系的基因，主流表达趋势所属基因将作为进一步研究的目标基因。（图中彩色部分即是主流趋势，p0.05）。lncRNA-mRNA共表达网络分析1. 通过构建差异lncRNA与mRNA的Coexpression网络，从所有差异lncRNA中筛选出和疾病密切相关的几个lncRNA（在网络中属性排名最靠前），并通过网络中lncRNA周边mRNA的功能来预测lncRNA的功能（绝大多数lncRNA功能都是未知的）。2. 分析方法—lncRNA-mRNA共表达网络获取关键lncRNAlncRNA-mRNA-network是结合lncRNA和mRNA相互作用关系的创新分析工具。lncRNA是当前研究的热点，虽然有一些对lncRNA的研究报道，但是绝大多数的lncRNA的功能和作用机制并不十分清楚。lncRNA-mRNA-network根据lncRNA及mRNA的芯片实测值，通过计算方法构建网络，可以帮助用户发现lncRNA与mRNA之间可能存在的作用关系，能够找到影响mRNA表达的调控lncRNA，从而发现网络中起中心调控作用的lncRNA及发现lncRNA可能存在的新作用机制