圆环病毒2型ORF2编码基因原核表达与初步应用研究.pdfVIP

中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 225 圆环病毒2型ORF2编码基因原核表达与初步应用 潘群兴“2，何孔旺”，黄克和2 (1．江苏省农业科学院兽医研究所-农业部畜禽疫病诊断重点开放实验室．江苏南京210014 2．南京农业大学，江苏南京210095) 其进行序列测定。重组质枉经受mill、加1l鼠酶切，回收ORF2基因．，定向克麈到表达载体pET一32a中并 转化大肠杆菌Roset怕，进行原核表达。用此表达产物包被酶标板．建立ELISA诊断方法．并对临床340份遥捡 血清进行了检测，结果表明其阳性率为z。 关键词：猪圆环病毒2型；ORF2基因；间接ELISA； 猪圆环病毒(porcine b 前者广泛存在于猪源肾细胞中，无致病性，基因组全长1759 MWS的 多系统衰弱综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PIvlWS)的猪群中分离到，是P 重要致病因子。 壳蛋白)，具有免疫原性，是病毒刺激机体产生中和抗体的重要抗原蛋白”】。因而对PCV-2而言，ORF2 蛋自最具有免疫原性，该蛋白可作为检PCV-2抗体的有力诊断工具。由于到目前为止。还没有有效预防 MW PCV-2感染的疫苗，致使P S等疾病有不断蔓延之势，已成为影响养猪业发展的重要传染病之一． 免疫荧光(IFA)，但这些方法主要用于检测病原，且对试验条件和技术要求较高。由于该病是近年来新发现 的猪的传染病，国内在这方面的研究工作才刚刚开始，为了弄清该病在我国的发病和流行情况，急需一种 简便、快速、敏感、特异且便于大规模应用的血清学诊断与检测方法。基于此，本研究以本室分离鉴定 的猪2型圆环病毒jS株为材料，克隆了其ORF2基因并对其进行了原核表达，以此表达产物为抗原包被酶 标板，建立了ELISA诊断方法，并在稿床上进行了应用。 1材料与方法 1．1主要试剂 工程有限公司，小量DNA胶回收试剂盒购自上海华瞬生物工程有限公司，DAB显色试剂盒、辣根过 态细胞Rosseta由本室制作并保存，Pcv2阴、阳性血清由南京农业大学传染病组陈溥言教授提供。 作者简介：潘群兴(1979．)，女，安徽怀宁人．博士研究生。从事临床病理与分子诊断学研究 E-mail：kwh2003@263．net +通讯作者：何孔旺(1963)，研究员，从事兽医分子微生物学研究Tel,．025 226 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 1．2引物设计 利用软件Primer 是1031—1734，可扩增包含整个Off2阅读框大小为721bp基因片段。 1．3病毒总DNA的提取组织样品 清样品与细胞增殖毒液：反复冻融3次待检。病毒DNA的提取参照殷震等病毒学”1。取上述待检样品 用70％的乙醇洗两遍，晾干。用TE缓冲液(10mmol／LTfis．HCI 溶解核酸沉淀，取适量进行PCR操作，其余，20℃保存备用。 1．4 PCR反应 xReaction dNTPs 30此友砬绣磊恸口人10 buffer2．5皿；25mMMgCl21．59L；2．5mM2¨L；50mM P21 0．5rtL；50mMP22 s， 72％延伸lmin。30个循环，最后72℃延伸10rain，4℃保存PCR产物。 1．5 T／A克隆与鉴定 扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳后，紫外灯下切割目的条带，用胶回收试剂盒(购自华