棉铃虫细胞色素P450的研讨.pdfVIP

棉铃虫细胞色素P450的研究 摘要 细胞色素P450单加氧酶系是一类广泛分布在生物有机体中的重要酶系，它能够代 谢多种内源性物质和外源性物质。因其生物学的重要性，一直是生物学领域研究的一个 重要对象。棉铃虫是一种在世界范围内普遍发生的重要害虫，能导致多种不同作物的严 重损失，为深入了解棉铃虫细胞色素P450的结构和功能，我们就棉铃虫单型P450基因 的克隆及水杨酸钠对棉铃虫单加氧酶的作用开展了研究，主要研究结果如下: 选用编码P450蛋白疏水螺旋I和编码血红素结合域的一对简并引物，利用反转录 一多聚酶链式反应 (RT-PCR)，从5龄末实验室品系棉铃虫中肠组织中克隆并筛选出10 个新的长度约4506p的cDNA片段。对这些序列与GeneBank的已知序列进行同源性分析， 初步推测这10个P450基因片段属于CYP4家族的CYP4M和CYP4S2个亚家族。 利用cDNA末端快速扩增 (3RACE)技术，以9=25-2#序列信息为基础，设计特异 引物GSP1与通用引物AUAP扩增其3‘端，获得3个新的cDNA片段:A2,A4,A5。经比对 分析表明:A2,A4属于CYP4L亚家族而A5属于CYP4M亚家族。 分析了5RACE失败的原因，并提出相应的改进措施:(1)保证RNA的完整性;(2) 在内部再设计一条特异引物进行巢式PCR;(3)提高二次扩增的退火温度;(4)用AP引 导cDNA的合成，以血红素结合区的保守序列作为下游引物与5RACE的通用引物AUAP 进行PCR扩增，然后以此PCR产物为模板进行巢式PCR，可以提高产物的特异性。 用CYP6家族保守序列设计的简并引物，从经用五甲基苯诱导48hrs的5龄末实验 室品系棉铃虫中肠组织中，利用RT-PCR法克隆并筛选出2个新的长度分别为237bp和 2406p的cDNA片段。序列分析表明，237bp的cDNA片段与棉铃虫P450CYP4家族有较 高的相似性，最高达73%;而240bp的cDNA片段与CYP6家族有较高的相似性，最高达 49%0 不同浓度 (12wg/g和1.2mg/g)的水杨酸钠对棉铃虫中肠和脂肪体微粒体P450的 对硝基苯甲醚0一脱甲基酶活性(ODM)没有显著作用，微粒体蛋白的SDS-P八GE电泳图谱中 拐铃虫细胞色素P450的研究 相应P450蛋白分子量范围内没有蛋白条带的明显加深现象。 建立了适用于昆虫细胞色素P450的mRNA差异显示技术的优化条件;选用Clontech 试剂盒中的锚定引物 (这些锚定引物有着合适的G/C含量)，与8条P450基因特异引物 进行组合，5WL反应体系中2W,反转录产物，上下游引物浓度均为。.2PM,Mg十浓度为 1.8mM,dNTPs浓度为2001,M，2.5U的ToqDNA聚合酶 (NEB),PCR反应条件为:94 Co温育3min，然后940C30s,400C2min,750C30s,5个循环;940C30s,480C2min,75 0C30s,30个循环;750C5min。在以上条件下，能够获得数量相对较多的cDNA条带。 关键词:棉铃虫，细胞色素P450，反转录一多聚酶链式反应，cDNA末端快速扩增，诱 导，mRNA差异显示 注:本项研究获 “十五”国家科技攻关项目(2001BA509B08)和国家自然科学基金 (No资助 棉铃虫细胞色素P450的研究 StudiesonCytochromeP450ofHelicoverpaarmigera AiYing(Zoology) DirectedbyHEFeng-Qin,AssociatedProfessorand QIUXing-Hui，PhD,AssociatedProfessor CytochromeP450-dependentmonooxygenasesareaveryimportantenzymatic system,whichhasbeenfoundinall