应用微载体技术生产TGEV试验研究.pdf

其他论文 应用微载体技术生产TGEV试验研究 邹勇1，周燕2，王建超2’华平2何锡忠1，苏万固’，唐永兰1，钱永清1 (1上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106，2华东理工走学上海200237) 摘要：本文系统地研究了微载体工艺生产猪传染性胃肠炎病毒的生产条件。ST最佳细胞生长条件为低糖 产的TGEV稀释10倍后免疫效果与方瓶工艺一致。 关键词：微载体：反应器；ST细胞；TGEv浼疫 微载体技术是上世纪60年代发明的新型细胞培养方法，该技术具有比表面积大，单位体积内细胞密 度高，生产稳定，劳动强度小和容易进行标准化控制的优点ltl，到1980年代国外许多公司开始运用该技术 生产生物制品口I，目前成功运用微载体技术生产的疫苗有狂犬病、脊髓灰质炎和甲肝疫苗等pI。 我国是个畜牧业大国，每年用于疾病预防的疫苗品种繁多、数苗巨大，而目前国内生产兽用疫苗基本上沿 用方瓶或滚瓶传统工艺，传统工艺生产疫苗受到细胞生长条件难于监控的限制，疫苗批次问质量差异人， 并且生产劳动强度高、占用空间大和生产不稳定等缺点，而微载体技术较好地克服了传统生产工艺的缺点． testicular 是实现大规模生产疫苗的有效途径【JJ。本研究l三l微载体技术生产猪睾丸细胞(swinecell，ST)和 transmissible virus．TGEV)，报告如下。 猪传染性胃肠炎病毒(porcine gastroenteritis l材料与方法 1．1 细胞和病毒sT细胞和TGEV病毒由上海市农业科学院畜牧兽医研究所保存 (New．BomCalfSerum．NBS，上海实生公司)和lOOU／ml的庆大霉素(上海医药集团公司)。 1．3转瓶(spinner 器(NBS公司)。 1．4硅化l％二甲基二氯硅烷的二甲苯溶液进行表面硅化处理，防止微载体粘在玻璃表面。待二甲苯溶 液自然挥发后，置于150～180℃烘箱内烘烤1．5小时，冷却备用。 1．5葡萄糖、乳酸和氨测定按试剂盒(卫生部上海生物制品研究所)说明书测定。 1．6 ST细胞培养工艺优化分别对sT细胞生跃培养液、微载体浓度和细胞接种密度参数进行工艺优化 1．7生产TGEV工艺优化分别对TGEV感染剂量、感染时间和维持液种类进行工艺优化。 1．8动物免疫试验最佳工艺生产的病毒按一定比例稀释后配制疫苗观察免疫效果。 2结果 2．1转瓶中批培养过程的sT细胞生长和代谢 图1．1表示了微载体上sT细胞的生长情况。对数生长期的平均细胞比生长速率为o．7day．1，最高细胞 细胞扩增了8．4倍，微载体上长满了细胞(图1．2)。但在后期随着细胞密度的增高，营养物质缺乏和搅拌 产生的流体剪切力对徽载体上细胞产生双重损害作用，到第6天细胞迅速从微载体上脱落。 2．2微载体生产ST细胞的工艺优化 2．2．1培养液种类对ST细胞生长的影响 MEM三种培养液考察不同培养基对ST细胞生长的影响。培养条件：微载体浓度3mg／ml，细胞接种密度 cells／ml。 为25x104 1128 第六次全国会员代表大会暨第11攻学术研讨舍 长，在更高的葡萄糖浓度下，多余的葡萄糖基本上都生成乳酸。MEM—F的葡萄糖消耗情况基本同低糖 途径，为细胞生长提供能量和物质来源。这正是低桔DMEM和MEM培养基所对应的细胞生长和最高细 胞密度出现差异的根本原因。 2．2．2培养液种类对sT细胞生长的影响 以3、5和IOmg／ml微载体浓度考察sT下细胞生长情况，其余 到的最高细胞密度分别为1．67、3．14和5．91x106 cells／ml。不同微载体浓度的最高细胞密度均达到每mg微 性，提供更多的贴壁面积，细胞密度也相应地成倍增加。但细胞生跃期的长短各不相同，微载体浓度越高， 生长期越长，10trl∥ml微载体浓度时至第6天才达到最高细胞密度。为了更快地获得较高密度的健康细胞 (有利于TGEV在细胞内增殖)，ST细胞的培养选用5mg／ml的微载体浓度是为宦，并能稳定地获得 3．0x106cells／ml以上密度的健康细胞。 保持较高的细胞比生长速率，并获得更高的细胞扩