阳离子脂质体介导的DNA转染的实验研讨.pdfVIP

阳离子脂质体介导的DNA转染的实验研究 1 2 1* 陈海靓 吴炜 梁文权 1. 浙江大学药物制剂研究所 浙江 杭州 310031 2.浙江大学 医学院传染病研究所 浙江 杭州 310003 基因转染是指将目的基因 DNA RNA 等 通过适宜技术输送到细胞内靶作用部位 由于DNA 等分子量大 水溶性高以及分子表面带有很强的负电荷 因此不能进入细胞内 为此 必须借助于一定的载体 才能实现目的基因的表达[1 2] 其中阳离子脂质体是一种有 效的载体之一 我们已经制备了一种能够有效促进细胞摄取反义寡核苷酸 antisense oligodeoxynucleotides, ODN 的 3â[N- N’,N’- 二甲基氨基乙基 氨基甲酸酯]- 胆固醇 DC-Chol 简称DC-Chol 脂质体 [3] 为进一步研究其介导的DNA 转染 本实验以编码 有增强型绿荧光蛋白的质粒 pEGFP 为报道基因 研究不同 DC-Chol 脂质体的组成和转 染条件对DNA 转染效率的影响 1. 材料 真核pEGFP 质粒 Clontech, 美国 18 聚荧光标记反义寡核苷酸 5´- CTC AGT TAG GGT TAG ACA-3´ 上海博亚生物有限公司合成 其中 5´用荧光素FAM 标记 N’,N’- 二甲基乙二胺 Aldrich, USA 酰氯胆固醇 Aldrich, USA DC-Chol 参照文献5 本 室合成 注射级大豆卵磷脂 Litoid SPC 二油酰脂酰乙醇胺 Sigma, DOPE ; Go3S Spin 高纯质粒抽提试剂盒 上海申能博彩生物技术有限公司 猴肾纤维母细胞COS-7 浙江大 学附属一院传染病研究所提供 RPMI1640 培养基 Gibco 美国 超级小牛血清 杭州 四季清生物制 品所 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 超声波细胞粉碎仪 宁波新芝仪器研究所 2. 方法 2.1 质粒扩增 抽提和鉴定 将含有 pEGFP-N1 质粒的大肠杆菌 DH-5á 菌种接种于 LB 培养基上 含卡那霉素 50 ìg/ml 按常规方法扩增 扩增菌液用试剂盒抽提 参照说明书 所得质粒用 0.8%凝胶 电泳鉴定 实验时用核酸检测仪测定DNA 贮备液浓度 A260 和A280 的比值 r 应符合转染 级别要求 r 值为 1.6~1.8 流式细胞仪 Coulter, 美国 荧光显微镜 Leica 德国 其他试剂皆为分析纯 2.1 DC-Chol 脂质体制备 参照文献 3 制备DC-Chol/SPC 脂质体 另以DOPE 代替 SPC 制备DC-Chol/DOPE 脂质体 2.3 载药脂质体的制备 基金项目 国家自然科学基金资助 . 通讯作者 梁文权 男 教授 博士生导师 Tel 0571 -872173756 E-mail wqliang@cmm.zju.edu.cn pEGFP 质粒和脂质体先分别用适宜介质稀释 将稀释的脂质体逐滴加入质粒溶液中 室温下混合 放置20min 即形成载药脂质体 质粒DNA 和脂质体的相对用量以+/- 电荷比表 示 正电荷以脂质体中DC-Chol 的含量计算 即每摩尔的DC-Chol 带 1 个单位的正电荷 负电荷以DNA 中所含的碱基数量计算 即每摩尔的碱基带1 个单位的负电荷 4 种碱基的 平均分子量以324.5 计 2.4 摄取实验 5 COS-7 细胞按2.0 10 个/孔接种于24 孔培养板中 培养过夜 次日换加无血清RPMI 1640 培养基950 µl 分别按+/- 电荷比0.5 1