月见草油抑制巨噬细胞炎症因子的作用研究.docVIP

精品论文 参考文献 月见草油抑制巨噬细胞炎症因子的作用研究 1宁夏医科大学回医药现代化省部共建教育部重点实验室；2宁夏医科大学总医院口腔医院； 3宁夏医科大学生育力保持建教育部重点实验室 宁夏银川 750004 【摘 要】探讨月见草油对巨噬细胞释放的炎症因子的抑制作用。结果显示月见草油对小鼠巨噬细胞的形态有显著性的改变，抑制脂多糖诱导后释放的炎症因子，RT-PCR结果表明月见草油显著性抑制了环氧合酶-2的表达（p＜0.05），降低了PGE2的表达水平；ELISA结果表明月见草油显著性地抑制和剂量依赖性地减少了一氧化氮合酶（iNOS）和肿瘤坏死因子（TNF-a）减少，白介素-1beta;（IL-1beta;）的产生（p＜0.05）。结果表明月见草油在炎症反应中扮演了保护作用，月见草油是一种功能性治疗药物。 前言 月见草油是从月见草（晚樱草）种子中提炼出来的油脂，其含有丰富的多聚不饱和必需脂肪酸，主要成分为gamma;-次亚麻油酸，已经报道其中omega;-6系列必须脂肪酸具有多项治疗作用，对心血管疾病，经前症候群，更年期综合征和糖尿病神经病变等具有疗效（1）。研究报道一氧一氧化氮在炎症反应和免疫反应中扮演重要的作用，巨噬细胞又是常见的一氧化氮合成的主要细胞来源，因此通过脂多糖诱导巨噬细胞iNOS合成，而且巨噬细胞能够产生TNF-a，IL-1beta;因子，巨噬细胞激活也可以产生环氧合酶，和前列腺E2（PGE2），这些因子在炎症反应的病理过程中具有重要的作用（2），本研究鉴于月见草对巨噬细胞产生的炎症反应报道较少，利用提取的月见草油研究对TNF-a，IL-1beta;因子和环氧合酶的影响， 1 材料和方法 1.1 材料和试剂 月见草油购自美国公司，含量为，按照比例贮存液溶解在DMSO中，工作液溶解在细胞培养液中.trizonl试剂和RPMI1640培养基购自life-tech公司，鼠iNOS合酶，鼠IL-1beta;，鼠TNF-a因子ELISA试剂盒均购自博士德生物公司，western试剂购自Cox-2抗体和PGE2抗体购自博奥森生物公司。 1.2 巨噬细胞培养及处理 按照实验室常规方法，解冻巨噬细胞RAW264.7，用RPMI1640基础培养基补充10%胎牛血清（FBeta;S），100iu请链霉素，以1x106个/ml密度接种，在培养箱24孔板中生长过夜，次日换新鲜培养基（5%FBeta;S）含有浓度为5ug/ml的LPS，同时添加不同浓度月见草油，实验分为高浓度组（200ug/ml），中浓度组（100ug/ml），低浓度组（50ug/ml）和空白对照组。 1.3 细胞增殖活力WST法检测 按照文献（4）常规试验方法用WST的方法评价月见草油对LPS诱导的炎症反应的效果。 1.4 ELISA法测量一氧化氮TNF-a减少，白介素-1beta;的产生 按照文献（2）常规方法分别取100ul的处理后的细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒的操作规程检测iNOS，TNF-a和IL-1beta;的吸光度值，利用说明书中标准溶液制备标准曲线，计算出各个处理对应的浓度。 1.5 RT-PCR检测PGE2和COX-2 mRNA表达 按照文献（5）常规方法对各组处理的RAW264.7细胞经过Trizonl试剂提取总RNA，经过逆转录和PCR反应，PCR特异性引物分别是：PGE2基因的上游引物5prime;-TTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3prime;，下游引物5prime;-CCTGTAGCCCACGTCGTAGC-3prime;；COX-2基因的上游引物5prime;-CACTACATCCTGACCCACTT-3prime;，下游引物5prime;-ATGCTCCTGCTTGAGTATGT-3ˊ；beta;-actin基因的上游引物5prime;-GTGGGCCGCCCTAGGCACCAG-3prime;，下游引物5prime;-GGAGGAAGAGGATGCGGCAGT-3prime;。PCR反应条件为95℃7min，94℃45s，60-65℃30s，72℃1 min，72℃10min，4℃forever，30个循环。经1.2%琼脂糖凝胶电泳和EBeta;染色分析PGE2和cox-2 mRNA表达 1.6 统计方法 实验数据以均数plusmn;标准差（plusmn;SD）表示。并应用SPSS17统计软件系统以T检验及单因素方差分析进行统计分析。检验标准采用P = 0.05。 2 结果 不同处理组月见草油对巨噬细胞生长情况的影响 巨噬细胞RAW264.7经过LPS单独诱导后