精氨酸脱亚胺酶发酵工艺及固定化研讨.pdfVIP

精氨酸脱亚胺酶发酵工艺及固定化研究 刘均忠李加友沈俞刘茜焦庆才 (南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室江苏南京210093) 摘要：研究了精氨酸脱亚胺酶的发酵生产工艺及转化条件，并对细胞进行了固定化试验。运 用单因子扫描方法，考察了不同碳源、氮源等影响因子对粪肠球菌(凸据mcoc∞s如￡∞如)NM02 产精氨酸脱亚胺酶的影响。优选出其较佳培养基组分为(g，L)：蔗糖15，蛋白胨5，酵母浸膏 和最适起始口H分别是37℃和7．5。与游离细胞相比，固定化细胞转化体系最适pH6_3基本不 变，但最佳转化温度提高了15℃，精氨酸脱亚胺酶的生物稳定性也有较大提高。 关键词：精氨酸脱亚胺酶；粪肠球菌；发酵；固定化细胞 精氨酸脱亚胺酶(AD：】作为一种新型抗肿瘤物质，已经受到越来越多研究者的重视。研究发现 ADI有较强的免疫抑制能力Ⅲ，可用于风湿性关节炎的治疗闭，也可能有提高肝功能的用途口】。另外， 由于ADI常见于原核生物，有高度的保守性，可以将ADI及其基因作为抗菌素和抗寄生虫药物的作用 蛋白氨基酸，是参与人体尿素循环的一个重要生化物质。L瓜氨酸有利尿作用，可同L鸟氨酸、L广精氨 酸等合用于治疗高氢血症w。 此前所报道的ADI均来源于支原体。而支原体为病原微生物，有较大危险性，且支原体为寄生性微 生物，培养难度大，不利于ADI的发酵生产。本实验研究了产ADI的菌株——粪肠球菌(曲据m∞ccⅪ 向Ⅻ出)Nj『柏2，发现该菌株安全性好，易于发酵制备，有利于ADI的大规模生产和临床应用。通过对 粪肠球菌NJ402发酵条件的研究。优选出最佳培养基组成及其发酵条件，并对该菌转化∽it的条件和 细胞固定化作了初步研究。 l材料与方法 1．1材料 1．1．1菌种 粪肠球菌(勘即加∞∞口血P∞蚴NJ402，本实验室保藏。 1．1．2培养基 ， 灭菌15111in。 作者简介：刘均忠(1982一)，男．博士研究生，师从焦庆才教授，主要从事酶工程和手性药物生物转化方面的研究， ’ com。 E-mail扣Ⅱzhonghu2414@163 基金项目：国家技术创新基金(02CJ-13-01-16) 发酵基本培养基(以)：牛肉膏2，蛋白胨5，酵母浸膏5，葡萄糖10，Nacl O．01，MnS040．0025，L精氨酸10；12l℃灭菌15nlin。 1．1．3仪器与试剂 公司)，u．3000分光光度计(日本Hitaclli公司)。 L精氨酸和L广瓜氨酸由上海医药试剂公司提供；蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏和玉米浆为生化试剂； 海藻酸钠和明胶为化学纯，其它试剂均为分析纯。 1．2方法 1．2．1菌种活化和种子制备 将实验菌接人斜面培养基活化，37‘c恒温培养8h，将活化后的斜面菌种接入种子培养基，37℃， 170r／Ⅱdn。振荡培养12h。 1．2．2摇瓶发酵 r／仃血 取种子培养液以5％接种量接入不同的发酵培养基，37℃，170r／nlill，振荡培养18h，。6000 离心收集发酵液中的菌体。 1．2，3精氨酸脱亚胺酶酶活测定 将所收集的湿菌体经cm址处理后，全部转入适当体积的0．5 6．3)中。立 m01几L广精氨酸溶液(pH min，测定转化液中新生成L广瓜氨酸的量。 即置于振荡器中37℃，17叫rrIin，振荡60 单位酶活(1u)定义：在上述条件下lmin新生成1umolL瓜氨酸的酶量，以1InL发酵液所含酶 活单位数量即比酶活(IJ，埘L)作为比较不同发酵条件对精氨酸脱亚氨酶活力影响的指标。 1．2．4固定化细胞制备 取1．09经c出处理过的湿菌体，用少量无菌水稀释成苗液，与15ⅡlL3％海藻酸钠溶液混合搅拌， 然后加入15mL3％明胶溶液混合乳化5IIlin一10嘶n。通过六号注射器针头将上述混合液滴人l％氯化钙 溶液中立即形成光滑的微球体，并将此固定化小球保持在40C的上述氯化钙溶液中硬化30nlill，然后在 一定浓度戊二醛溶液中进一步硬