蛋白酶的生产和应用研究.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文集 蛋白酶的生产和应用 胡学智 (上海中科伍佰豪生物工程公司) 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶，是酶学研究中较早也是最深入的一种酶。到本 世纪初，已经报导的微生物蛋白酶估计超过900种嘲，生物体的生理活动和疾病的发生 如食物之消化吸收、血液之凝固、溶血作用、炎症、血压调节、细胞分化自溶，机体衰老、癌 症转移、生理活性肽的活化等，莫不同蛋白酶有关[1矗]。 蛋白酶也同人类生活资料的生产息息相关，涉及人类生活的方方面面，全球酶制剂 市场中蛋白酶的销售额达到60％[3“]。以下就个人多年来从事蛋白酶的生产和应用开发 的一些学习体会做一汇报与大家交流。 1 关于蛋白酶的分类与专一性 蛋白酶分为外肽酶和内肽酶两大类，外肽酶只对底物的C端或N端的肽键有作用， 内肽酶只能水解大分子蛋白内部的肽键，是真正的蛋白酶。 曾经有过多种分类蛋白酶的方法，但都不够完善，有的以活性中心来分，或者以作用 方式来分，也有的以最适PH来分，学术上都以活性中心来分。 按活性中心可将蛋白酶分为四类：①丝氨酸蛋白酶②天门冬氨酸蛋白酶③半胱氨酸 蛋白酶④金属蛋白酶。如表1所示。 (1)丝氨酸蛋白酶：这类酶广泛存在于动物胰脏、细菌、霉菌中，活性中心含丝氨酸残 的专一性抑制。酶的最适PH在9．5--,10．5是碱性蛋白酶，但个别丝氨酸蛋白酶是中性 蛋白酶，有些因活性中心也含半胱氨酸残基也可被巯基试剂对氯汞苯甲酸(PCMB)所抑 制．对底物的专一性类似于糜胰蛋白酶，可优先切开羧基侧是芳香族氨基酸如酪氨酸、 苯丙氨酸或疏水性氨基酸如亮氨酸所构成的肽键，酶分子量在15—30Kda，等电点PI约 9，在低温下于PH9-一10稳定，但65℃时迅速失活。某些嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶最适 PH达11～12，PI在11左右在碱性甚稳定。 生产碱性丝氨酸蛋白酶的微生物有节杆菌、链霉菌、黄杆菌、芽孢杆菌等细菌，在酵 母、链孢霉、曲霉、担子菌等真菌中也存在碱性蛋白酶，丝氨酸蛋白酶依其专一性还可分 为胰蛋白酶型、糜蛋白酶型、粘细菌和葡萄球菌型四种类型。其中地衣芽孢杆菌生产的 碱性蛋白酶因广泛使用在洗涤剂中，年产酶蛋白达500吨之多，故知名度最高。 (2)金属蛋白酶：这类蛋白酶主要是中性蛋白酶，最适PH?～8，活性中心大多数含 此类蛋白酶因较不稳定，用途有限，其重要性不及碱性和酸性蛋白酶。金属蛋白酶中也 第四次全国发酵工程学术讨论会 包括了铜绿色假单孢杆菌的碱性蛋白酶、蛇毒和胶原酶。微生物金属中性蛋白酶如细 菌、霉菌中性蛋白酶可切开氨基端由疏水性或其他氨基酸残基构成的肽键。枯草杆菌中 素在80℃加热60min可保存50％的活性，由于中性蛋白酶易自溶致使酶的提取和应用 产生困难。 中性蛋白酶广泛存在于曲霉、芽孢杆菌、链霉菌等中，许多曲霉生产中性蛋白酶外还 产生碱性和酸性蛋白酶及外肽酶。芽孢杆菌有的菌株还同时可生产碱性蛋白酶。但也 有些芽孢杆菌只产中性蛋白酶一种。 衰1 微生物蛋白酶的分类和底物专一性 注：PFP：二异丙基磷酰氟PCMB：对氯汞苯甲酸 PMSF：苯甲基磺酰氟DAN：重氮乙酰正-DL-亮氨酸甲醇 PI：马铃薯蛋白酶抑制剂 OP：郝二氮杂菲)(菲绕啉) EDTA,L--胺四乙酸 (3)天门冬氨酸酶：胃蛋白酶、真菌酸性蛋白酶都是活性中心含天门冬氨酸的酸性蛋 34．5， 白酶，这类酶的最适PH2．0-5．0，在酸性稳定，在PH高于6迅速失活，酶的PI 性抑制剂，酶的分子量30一--45KDa。微生物酸性蛋白酶可分成两大类型，即胃蛋白酶型 胡学智：蛋白酶的生产和应用 741 和凝乳酶型，产生前一类型酶的微生物主要是曲霉、根霉、青霉，产生后一类型酶的菌种 有栗疫霉、毛霉等。微生物的酸性蛋白酶的专一性类似胃蛋白酶，但不像胃蛋白