T7Select噬菌体展示单链抗体库的构建及抗CD44v6单链抗体的筛选.pdfVIP

③士，：!：j!∑薰T7Select噬菌体展示单链抗体库的构建及抗c。44v6单链抗体的筛选 T7Select噬菌体展示单链抗体库的构建及抗 CD44v6单链抗体的筛选 学科专业：消化内科 学位申请人： 李学先 导 师： 黄开红教授 中山大学附属第二医院消化内科 中文摘要 第一章全套抗体重链、轻链的克隆 目的 从消化道肿瘤患者外周血中分离淋巴细胞，克隆人全套抗体重链、轻链基因， 并重组连接成抗体库构建所需要的VH—linker-VL单链抗体基因。 方法 腺癌(1人x5ml／人)。密度梯度分离人外周血淋巴细胞，RT-PCR方法扩增全套 重链、轻链基因：重叠延伸PCR法构建重组VH—linker-VL单链抗体基因。PCR I、Not 引物合成时引入Sal I酶切位点和linker连接片段(Gly。Ser)。。 结果 RT-PCR克隆得到重链基因产物长度均在400bp左右，K轻链基因产物长度 均在400bp左右，入轻链基因产物长度均在400bp左右。+重叠延伸PCR构建得 I ◎=}，燃T／Select噬菌体展示单链抗体库的构建及抗CD44v6单链抗体的筛选 到VH—linker-VL(K／入)单链抗体基因，产物片段约800bp大小。 结论 库的成功构建提供基础。 I 第二章T7Se ect单链抗体库的构建 目的 构建T7Select单链抗体库，并测定抗体库的容量。 方法 分别对单链抗体基因和T71—2b噬菌体载体DNA进行双酶切，然后用T4连 接酶把单链抗体基因克隆进T7载体DNA，然后进行噬菌体体外包装，构建初级 抗体库。系列倍比稀释后铺板，测定抗体库库容。初级抗体库经液体扩增后得次 级抗体库，再次测定单链抗体库库容。 结果 初级抗体库库容为l×103，次级抗体库库容为4×109。 结论 本部分实验成功构建了TTSelect单链抗体库，库容高达4×109，为筛选抗 CD44v6单链抗体奠定了基础。 第三章抗CD44v6单链抗体的筛选 目的 筛选融合表达抗CD44v6单链抗体的重组噬菌体，并PCR扩增目的片段， 进行进一步分析鉴定。 方法 FITC免疫荧光标记观察胃癌细胞系SGC7901 CD44v6蛋白表达情况。收集 U ⑧=}，燃纛 T7Select噬菌体展示单链抗体库的构建及抗CIM4v6单链抗体的筛选 培养SGC7901细胞，提取膜蛋白：然后从膜蛋白中免疫磁珠亲和纯化得到 BLAST 轮。PCR扩增第三轮筛选得到的重组噬菌体，测序，并用Ig me．html)在线工具对单链抗体蛋白质构象进行预测。 结果 SGC7901高表达CD44v6蛋白。平板试验显示从第一轮筛选到第三轮筛选重 组噬菌体表现出明显的富集现象：第一轮筛选噬菌体滴度1．7×108；第二轮1．3 Blast序列比对显示单链抗体基因由重链基因 示插入片段长度为768bp。Ig 构成。Gen03D以2GKI蛋白构象为模板成功预测了单链抗体的三级结构。 结论 本部分实验成功筛选到表达抗CD44v6单链抗体重组噬菌体，并克隆出插入 片段进行测序分析，不仪验证了单链抗体库的有效性，而且成功筛选到了抗 CD44v6单链抗体基因，为后续胃癌治疗性单链抗体的表达奠定了基础。 关键词：单链抗体，噬菌体展示，CD44v6，T7噬菌体