小鼠 nulp1基因多克隆抗血清的制备及检测.pdfVIP

第 33卷第 5期 怀化学院学报 V01．33．No．5 2014年 5月 JOURNALOFHUAIHUA UNIVERSITY M ay．20 14 小鼠nutp1基因多克隆抗血清的制备及检测 易 珍 ， 袁佳佳 ， 冯德峰， 王盼盼， 邓 云， 吴秀山 (湖南师范大学 生命科学学院， 湖南 长沙 410081) 摘 要 ：为 了在小鼠模型中更深入地研究 nU,1蛋 白在心脏发育中的功能，采用PCR技术扩增 出小鼠nu如1基 因 的部分编码 区并连接入 pET一28a表达载体 中，之后将重组质粒转入大肠杆菌 (E．coli)通过 IPTG诱导表达 His— nulpl融合蛋 白，对该融合蛋 白采用 Ni—IDA凝胶柱层析纯化后 ，免疫新西兰兔制备 了多克 隆抗体 ，并用 western blotting对抗体进行分析 ．结果表明，获得了高效价的特异性兔抗 ,~up／1多克隆抗体 ．这为n“fpl功能的进一步研究奠 定 了基础 ． 关键词：n 1； 小鼠； 原核表达； 多克隆抗体 中图分类号 ：Q341 文献标识码 ：A 文章编号 ：1671—9743(2014)5—0037—04 碱性螺旋 一环 一螺旋蛋 白 (basichelix—loop—helix， 现_5]．但是 目前对 nup／1基 因的功能报道还不是很多， bHLH)是真核生物中的一种特殊的转录因子，其家族 因此，制备 nulp1的多克隆抗体十分必要 ．本文通过在 成员可 以和其别的蛋 白以二聚体复合物的形式进而完 NCBI数据库中对小鼠 nulpl基因的生物信息学分析， 成转录作用 ．它们在肌细胞发生 、心脏发育和血细胞 克隆了亲水性较高的一段核苷酸序列，并构建了原核 发生等过程 中发挥着重要的调节作用_1J．人类 nufp1基 表达载体 ，通过 IPTG诱导表达 ，并大量纯化蛋 白，最 因位于染色体 16q24．3位置，在小鼠中位于 8号染色体 终制备效价较高特异性较好的多克隆抗体 ．对进一步 上 ．含有碱性螺旋 一环 一螺旋结构域 (bHLH)，一个 研究利用小 鼠模型研究 nup／1基 因在心脏发育 中的功 UF654结构域位于 c端_2j，另一个 bHLH结构域位于 N 能奠定基础 ． 端 ．用生物信息学网站比对同源序列发现与小鼠序列 1 材料与方法 同源度高达 82％．与此同时，DUF654结构域也相当保 守 ，与小鼠序列同源度高达 92．1％．说明此蛋 白所在 1．1 主要试剂 的亚家族可能具有相当重要的功能 ． 大肠杆菌 E．coliDH5a、BL21菌株、pET一28a空表 在小鼠胚胎中发现该基因在肾脏，神经系统 ，和 达载体菌种由本实验室提供；pMD18一T克隆载体购 自 心脏 中表达强烈 ，而在肝脏和皮肤 中表达较弱_3]．根 大连宝生物公 司；限制性 内切酶 BarnHI和 SalI， 据我们实验室前期研究结果表明：nup／1可能通过抑制 TaqDNA聚合酶购 自深圳精美公司；新西兰大 白兔购 wnt 一catenin信号通路而抑制心肌分化 4¨；此外 ， 自中南大学湘雅医院；其它化学试剂为 Sigma分析纯产 hnulp1在人类成体心脏发育晚期表达强烈 ，该蛋 白作 品 ． 为一个转录抑制子在细胞系 中对 SRF信号途径起着极 1．2 引物设计与合成 强的抑制作用，并且该抑制作用 由DUF654结构域来实 从NCBI数据库中提供的小鼠 nulp1基因信息为依 收稿 日期 ：2014—02—17 基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目 “心脏和骨骼肌特异表达基 因KLHL31在心脏左右不对称形态发育中