大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP-SNAT3融合蛋白的表达与鉴定.pdfVIP

第43卷第2期 上海师范大学学报(自然科学版) Vo1．43．No．2 2014年 4月 JournalofShanghaiNormalUniversity(NaturalSciences) Apr．，20 14 DOI：l0．3969／1．1SSN．100—5137．2014．02．011 大 鼠谷氨酰胺转运蛋 白EGFP．SNAT3融合蛋 白 的表达与鉴定 李 敏 ，闵伟勇 ，张 舟2 (1．上海师范大学 生命与环境科学学院，上海 200234；2．沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院，沈阳 110016) 摘 要 ：SLC38基 因家族编码的Na偶联的中性氨基酸转运蛋 白3(SNAT3)是 SystemN中的 一 员．它在大脑谷氨酸一谷氨酰胺循环 以及肝细胞质膜的谷氨酰胺转运等生理过程 中发挥着重 要作用．为了方便检测 SNAT3在细胞膜上的表达与定位，本研究采用PCR扩增和酶切连接技 术将增强型绿色荧光蛋 白(EGFP)与SNAT3的 N末端连接 ，通过菌液PCR、酶切和 DNA测序 验证得到pBK—CMV(A[1098—1300])一EGFP—SNAT3重组真核表达质粒．用脂质体转染法 将构建好的质粒瞬时转染进入人体胚肾细胞 (HEK293Tcells)，利用激光扫描共聚焦显微镜和 Westernblot技术检测 EGFP—SNAT3融合蛋 白的表达和亚细胞定位．结果表 明，EGFP— SNAT3重组质粒在细胞中正确表达并定位于细胞膜上．EGFP—SNAT3重组质粒的成功构建 将有助于 日后进一步研究SNAT3的结构和功能． 关键词：增强型绿色荧光蛋白；EGFP—SNAT3融合蛋白；质粒构建；表达鉴定 中图分类号：Q31 文献标识码 ：A 文章编号：1000．5137(2014)0243180-08 0 引 言 Na依赖的中性氨基酸转运蛋 白(Sodium．coupledNeutralAminoAcidTransporters，SNATs)属于 SLC38基因家族．根据功能特性和调控模式，SLC38家族分为 SystemA和 SystemN两个亚型，其 中 SNAT1、SNAT2、SNAT4属于SystemA；SNAT3、SNAT5属于 SystemN¨-4j．SNAT1和 SNAT3是 SLC38家 族 中首先发现的Na偶联的中性氨基酸转运蛋 白 J．除了SNAT4外，SLC38家族 中的成员均偏爱转 运 L一谷氨酰胺 ¨J． 谷氨酰胺(Glutamine，Gln)是人血浆 中浓度最高的氨基酸 ，系统性的Gln缺乏将引起多系统疾病 和致命的多器官功能衰竭 J．作为蛋 白质的组成成分之一，Gln在胚胎的生长过程中有着多重作用 J． 它参与了柠檬酸循环、核苷酸和蛋白质的生物合成以及氨代谢，也是神经递质 一氨基丁酸(GABA)和 抗氧化剂谷胱甘肽的前体物质 ．在大脑和肝脏中，由谷氨酰胺合成酶合成 Gin是氨代谢中的关键环 节…J．Gin通过谷氨酸一谷氨酰胺循环为大脑兴奋性神经递质谷氨酸的合成提供底物，参与大脑能量 代谢，直接关系到大脑的兴奋性和抑制性调控 ¨ ”．胎盘 中也存在谷氨酸 一谷氨酰胺循环，Gln从胎盘 释放进入胎儿的血液循环，提供胎儿生长所需的氨基酸 ¨ ．Gln发挥 以上这些作用均离不开转运蛋 白的协助，而在Gln的摄取和释放过程中，SLC38家族的成员SNAT3扮演着关键角色． SNAT3由SLC38A3基因编码 ，主要定位于星形胶质细胞的细胞质膜上 ’ ，为 SystemN中的标志 收稿 日期 ：2014-02—19 基金项 目：国家 自然基金资助项 目；上海市教育委员会科研创新项 目(13ZZ103) 作者简介：李 敏，女 ，硕士研究生；张 舟，女，教授． 通信作者 ：张 舟 ，E·mail：zhouzhang@hotmail。con 第 2期 李 敏，闵伟勇，张 舟：大鼠谷氨酰胺转运蛋白EGFP—SNAT3融合蛋白的表达与鉴定 181 性成员．SNAT3对pH敏感 ，它通过反向转运一个H 的方式共转运氨基酸_4’删J．研究发现，SNAT3 和SNAT5共同起作用，在大脑中