马铃薯主要病毒多抗DASELISA检测试剂制备的研讨.pdfVIP

马铃薯主要病毒多抗DAS-ELISA检测 试剂制备的研究 白艳菊，李学湛，吕典秋。于德才，马纪 (黑龙江省农科院植物脱毒苗木研究所．150086) 摘要：采用指示植物分离马铃薯主要病毒的毒源材料．并扩繁病毒．繁毒材料经差 速离心PEG沉淀和蔗糖密度梯鹰离心，得到纯病毒，病毒免瘦家免．从家兔身上提病毒抗 血清，抗血清妊lgc纯化和酶标记IKG后测出适宜工作浓度．接照DAS—ELISA检测中所hl 试剌进行各缓冲液的混配、分囊，与稀释好的I躬和酶标记Izc纽襄成完垫的马铃薯主要病 毒赣测试剂。 荚键词：马铃薯Y病毒(PVy)；马铃薯x嫡毒(PVXl；马斡薯卷叶病毒(PLRv)；马铃 薯A病毒(PVA)；马饽薯S病毒(PVS)；马铃薯M病毒(PVM)；检测试舟J 据报道，可侵染马铃薯的病毒有25种以上不同病毒和1种类病毒ili，所幸只有少 数病毒对马铃薯会产生较大危害，马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯x病毒(PVX)、马铃 (PVM)是世界公认的影响马铃磐生产的主要病毒。病毒侵染马铃薯会造成不同程度的 产量损失和质量损失，严重的在敏感品种上减产达80％～90％[21。病毒的复合侵染则给 马铃薯造成更大危害。 目前，国际上对马铃薯生产的监督和种薯质量检测，DAS—E1．ISA法因其具有快速、 特异性好和可以大批量检测的特点而普遍采用，艮在所有马铃薯病毒检测方法中多抗 DAS—ELlSA检测方法的利用率占有绝对优势，多克隆病毒抗血清制备是检测i式剂制备 中的关键内容，但完整的DAS—ELlSA检测试剂制螽还包括：病毒抗血清IgG纯化、酶 标汜lgG和各种缓冲液配置等内容，一个高质量的病毒检测试剂的制爵是所有内容高质 量、和谐、优化、统一的完美体现。本文对这6种马铃薯主要病毒多抗DAS—ELISA检 测试剂制备的全部过程和结果进行简要分析报道。 l材料与方法 1．1材料 (i)供试毒源：采自黑龙江孝晗尔滨市郊马铃薯生产田。 (2)供试昆虫：桃蚜脚档“pe,jicae(Sulz) (3)指示植物：用于分离、纯化和繁殖6种马铃薯病毒的指示植物部分来自于李芝 芳、崔荣晶先生惠赠，部分来自于国际马铃薯中心惠赠(详觅表I)。 (4)供试兔子：2～3k雄兔。 ～J37—— (5)碱性磷酸酶：购自Sigma。 (6)对照检测试剂盒：瑞士Biorab。 衰1主要马铃薯病毒的鉴别寄主 1．2方法 和PLRV，筛选吸光值较高、感染单一病毒的样品，尽量不用复合浸染的样品，然后电 镜观察2％醋酸铀负染的毒源样品是否混有ELISA检测之外的其他病毒，确定毒源。幸 运的是，我们利用农业部田检任务从大批样品中筛选出比较单一的，浓度较高的毒源材 料。 (2)接种：不同病毒的接种方法有差异，首次接种选用能产生局部症状的指示植 M磷酸缓冲液含O．2M 物m，摩擦接种缓冲液为0．025 NaDIECA，ptt7．2)≤见表2)。病 毒增殖选用接种病毒增值快、病毒回收量较大的指示植物14J。 表2接种方法和首次接种的指示植物 (3)病毒提纯：根据不同病毒粒体形态、特性采用不同的提纯方法，病毒粗提采用 差速离心，然后采用蔗糖10％-．40％密度梯度离心。具体方法参考Salarza、孟清等人的 d后收获．100 提纯方法。并作适当修改。病毒接种繁殖寄主15—20 g一袋，一20。C保 存，提纯时低温捣碎、研磨，加2倍体积(w／v)的0．1M磷酸缓冲液(pH8．0，含0．2％巯 tool 基乙醇和10％乙醇)，三层纱布过滤，差速离，Ik,，4％PEG沉淀(分子量6000)，0．05 磷酸缓冲液悬浮，(含l％TritonX一100)，悬液10％一40％蔗糖密度梯度离心，收集