MALDITOFMS法测定几种蛋白质的分子量研究.pdfVIP

参 考 文 献 1.KarasM,NahrU,CiehmannU.MassSpectroRew,1991.,19:335 2.NordhoftE,KirpekarF,RoepstorffP.MassSpectromRew,1996,15:67一138 3.董方霆、廖杰等，色《谱》，1997,15:420一422, MALDI一TOF一MS法测定几种 蛋白质的分子量 李怡萍 刘淑莹 (中国科学院长春J!用化学研究所 长春 130022) 摘要 本文应用激光解吸电离飞行时间质4(MALDI-TOF-MS)技术成功地分析了八 种生物大分子的分子质量与纯度，并对其结果进行了讨论，认为选择适宜的分析条件如基质的 选择、样品浓度、激光强度等是获得最佳分析结果的可靠保证。 自80年代末MALDI-,rOF一MS技术问世以来，以其高灵敏度、分析速度快、直观准确、 极高的质量 卜限，良好的软“电离.，性质对杂质的包容性以及可直接分析混合物而无需预先分 离等特点，广泛应用于生物化学领域，显示出独特的潜力和应用前景。 本文采用了激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI一TOF一MS)技术，对梅花鹿茸多肤、重 组人肿瘤坏死因子a衍生物、天花粉蛋白、细胞色素C、核糖核酸酶、磷脂酶、纤溶酶、猪胰岛素 等生物大分子的分子量与纯度进行了测定。结果表明本方法具有高灵敏度(10一12mol)、分析 速度快(十五分钟一个样品)、信息直观(离子化的蛋白不碎裂)、准确度高(I%--0.10k)、质量 范围宽(可达30万Da)等特点，优于其它传统测定生物大分子质量方法。目前已成为侧定生 物大分子分子量与纯度的理想分析工具 1.实验部分 1.1仪器与试剂。LDI一1700激光解吸电离飞行时间质谱仪(美国LinearScieutific公 司)氟激光器，波长337nm,脉冲宽度3ns，加速电压30kV检测电压一4.7kV,真空度为 1x10一5Pa，以正离子方式检测 基质:芥子酸(Sinapinicacid),a一氰基一4一经基肉桂酸(A一CHC)} 所用样品:梅花鹿茸多肤.T组人肿瘤坏死因子。衍生物、天花粉蛋白、细胞色素C、核糖 核酸酶、磷脂酶、纤溶酶、猪胰岛素 1.2实验方法 根据样品的浓度与基质溶液配比适当，取1户样品溶液滴于进样探头 L，抽空除去溶剂，使样品与基质混合物在探头L形成均匀的结晶，直接进样分析 32 2结果与i寸论 生物样品不仅分子量大，而月极不稳定致使电子轰击(El)、化学电离 (CI)等无能为力 M.ALDI等新型离子源解决r小少卞物样品的电离问题-一般情况 卜随着 分f-量的增lip.IIIP,-的难度91逐渐增加，i-要体现在灵敏度和分f-R的测量精度等方A的显著 IF降 讨上质鼠数在五道尔顿以下的生物分子，分子量测定准确度可优 卜0.47,，分子量更大 的生物分子则测定准确度相对低些 尽节如此，仍远远优于常规使用的测定生物分子力一法，如 凝胶电泳，超速离心法等- 我们先后对八种生物样品进行了测定，实验结果列入,rI,激光质i如图所示 实验测得 的分价量与理论计算得到的分子量的误差小于0.4%,丙此对 一些含氢极低，难以分离纯化的 ，}一物分子是 种非常适宜的高灵敏检测手段 以纤溶酶为例，图4中的n/z23367峰为质 子化分厂离子峰即 n1+I11峰、m/z 11693.3和m;z 46747.4分别对应于纤溶酶的双电 荷离子峰 M十2I钊2’和三聚体离子峰[2M十H 同时还出现犷三、四聚沐离子峰即3M+ 日一、一4M十HI双电荷离子峰的出现是对分子离子峰的进 步印证。同理 另外七种生物 样品的MALDI一FO‘F一MS也有相似的结果 MALI”一TOF一MS法可以有效地检测出生 物大分子的准分子离J七峰，同时还伴有双电1u7离-f峰和多聚体离r峰，由于它们分r量之间具 有倍数关系.故可确定其峰的归属_具中分子离f-峰最高，这 一特征便于确认分子堡 该方法 特别适川于测定生物大分子的分f13.纯R、杂质.也e3测定稀少样品或昂贵样品的经济方法 ^ 一 ︼ ， ‘