鲷鱼肌肉蛋白的分解及影响因素研究.pdfVIP

强毽ln。 第三届海洋生物高技术论坛 200s．08．19．23 鲷鱼肌肉蛋白的分解及影响因素+ 曹敏杰州，翁凌1，蒋欣静1’2，王锡昌2，苏文金1 摘要：研究了鲷鱼死后肌肉蛋白在不同条件下的分解情况。实验结果以聚丙烯酰胺电泳 (SDS—PAGE)或免疫印迹法鉴定。加热温度为250C时，肌肉蛋白的分解作用不明显。而温度 提高至400c以上时，肌肉蛋白尤其是肌球蛋白重链(MHc)的分解显著。盐浓度的增加有利 于MHC的分解，提示盐溶性蛋白MHC中的蛋白酶酶切位点随盐浓度的提高而更多暴露， 易受蛋白酶的攻击。钙离子浓度变化对分解作用影响不大。即使在70。c下，无论是肌浆蛋 白还是肌原纤维蛋白其分解作用仍很明显，表明参与分解作用的蛋白酶有高度热稳定性且在 肌浆和肌原纤维中均有存在。 关键词：鲷鱼；肌原纤维；电泳；免疫印迹 鱼类死后，必然伴随着由肌肉细胞内外各种蛋白酶作用而引起的肌肉蛋白质的分解。此 种分解作用的直接现象是鱼体肌肉的软化。最近研究认为冷藏鱼肌肉软化的主要原因是蛋白 酶对细胞外基质蛋白，尤其是v型胶原蛋白的分解所致【I一】。此外，关于I型胶原蛋白分解 与鱼体肌肉软化之间关系的研究也有相关报道【34】。鱼类较之哺乳动物和家禽类在死后更快进 入僵硬期和自溶期的特点表明，其体内的各种酶，特别是蛋白酶的相对活性比哺乳动物和家 禽类高，因此，更具有研究价值。迄今为止，对于哺乳动物肌肉蛋白的分解已有相当多的研 究‘5，6·71。但是对于作为鱼类肌肉蛋白主要成分的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白在鱼体死后变化情 况的研究在国内外均鲜有报道。本实验以海水鲷鱼为研究对象，探讨了肌浆蛋白和肌原纤维 蛋白在不同条件下的变化特点，为今后对鱼类肌肉蛋白作进一步研究打下基础。 1材料与方法 1．1原料与试剂 由集美市场购鲜活养殖真鲷(Pagrosomusmajor)(体重400g)即杀后得背部肌肉，立即 使用或冻存于一800C冰箱待用。 从New BioLab公司购得。大鼠抗真鲷原肌球蛋白多克隆抗体由本研究室保存。大鼠 England 抗真鲷0c辅肌动蛋白、肌动蛋白多克隆抗体由日本长崎大学水产学部橘胜康教授提供。兔抗 大鼠IgG—HRP由DAKO公司购得。其它试剂均为国产分析纯品。 +福建省自然科学基金(C04l0036)；教育部留学回国人员科研基金 ‘通讯作者。Email：mjcao@jmu．edu．cn 780 福毽凌门 第三届海洋生物高技术论坛 2005。08．19．23 1．2仪器设备 1．3肌肉总蛋白、肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的制备 鲷鱼背肌(重约109)用组织捣碎机以9倍体积的冰冷20mM磷酸缓冲液(pH7．5)捣碎。重 复两次(每次不超过30S，中间间隔1min)，将悬浮液经绢布过滤即得肌肉总蛋白。悬浮液 min，得上清为肌浆蛋白。将沉淀重新悬浮于4倍体积的去离子水中并捣 于9000xg离心15 碎，再以同样的条件离心，再次取用沉淀，如此重复四次。将最后一次离心得到的沉淀溶解 M M 在含有0．5 NaCI的O．1 7．5缓冲液中，得到的溶液即为鲷鱼肌原纤维蛋白。 Tris．HCl，pH 取肌肉总蛋白、肌浆蛋白或肌原纤维蛋白100rtL置于1．5mL的Eppendorf管中，在不同条 min 件下于恒温水浴中加热处理后，立即加入50阻。的4xSDS上样缓冲液并在95。C下加热5 后作电泳分析。 1．4 BIot SDS及Western SDS—PAGE参照Laemmli法【81进行以考马氏亮蓝染色；Westernblot依照Towbin法【91进行 以_氨基联苯胺(3，3’diaminobenzidine，DAB)显色。 2结果与讨论 2．1 250C下鲷鱼肌肉蛋白的分解 鲷鱼肌肉蛋白在250C下加热时其分解作用不明显，即使加热24h，只观察到肌球蛋白重 链的少量分解(图1)，表明在该温度下参与蛋白质降解的蛋白酶活性较低。此结果与报道的 自我分解最适温度为250