ATG4C基因的提取与转入.pptVIP

姓名： 学号： 综合创新性实验报告——磷酸化自噬相关蛋白4C抗体phgophs-ATG4C基因与载体的连接与转化 Macroautophagy(自噬)是主要的细胞内蛋白质的降解途径对长寿和细胞器。此外,异常的自噬中发挥作用的主要健康问题包括癌症和神经退行性疾病。ATG4C是一种与自噬有关的抗体蛋白，人体中它有458个氨基酸组成。在2007年马利尼奥发现它具有抑制癌细胞的作用。 （Mari?o G, Salvador-Montoliu N, Fueyo A, Knecht E, Mizushima N, López-Otín C. J Biol Chem. 2007 Jun 22;282(25):18573-83. Epub 2007 Apr 17. Tissue-specific autophagy alterations and increased tumorigenesis in mice deficient in Atg4C/autophagin-3.） （1）实验仪器：电子天平、纯水系统、离心机、高压蒸汽灭菌器、台式离心机、-70℃低温冰箱、微量移液器、高速冷冻离心机 超净工作台、电热恒温水浴箱、电泳槽、紫外-可见分光光度计、电泳仪、凝胶图像分析仪、细菌培养箱、自动台式灭菌器、恒温空气浴振荡器、UV投射仪 （2）实验试剂:pSilencer1.0-U6质粒、大肠杆菌JM109、T4DNA连接酶、小量质粒提取试剂盒、限制性内切酶、BamHⅠ 、HindⅢ、 10×T4DNA连接酶缓冲液、无核酶水、75%的冰冻乙醇、氯仿（三氯甲烷）、异丙醇、RNase free dH2O（去RNA酶的水）无Ca2+、Mg2+ Hank’s液、含10%～20% 灭活小牛血清Hank’s液 引物的获取 Atg4C的基因序列编号为：ENST00000317868，本实验研究其较长的ccDNA中的部分基因。 试验中扩增445至976共532bp，其引物信息为： 正链引物：TGGACTTCCCACACTGTCAAA G+C= 47.62% Tm=55.64℃ 负链引物：TGCCACCAATAATACCCACAC G+C= 47.62% Tm= 54.52℃ 实验仪器和试剂 3、实验研究方案 （1）外周血白细胞的分离 人外周血红细胞与白细胞的比例约为6000～1000:1，两类细胞的沉降速度不同，据此加以分离。自然沉降法是利用红细胞自然沉降率较快加以分离。该法简便易行，对细胞损伤少，但纯度差。 【试剂及配制】 (1) 无Ca2+、Mg2+ Hank’s液 (2) 含10%～20% 灭活小牛血清Hank’s液 【操作方法】 (1) 取静脉血2ml，放入加有抗凝剂的试管中，轻轻混匀; (2) 将试管直立静置于室温或37℃温箱中30～60min，待红细胞自然沉降。此时可见试管中的悬液分3层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，在紧贴红细胞层上有一呈灰白色的白细胞层； (3) 用毛细管吸取位于红细胞层上面的富含白细胞的细胞悬液，移入另一试管中； (4) 加入无Ca2+、Mg2+Hank’s液至离试管口3cm处，混匀，以水平离心机2000r/min 离心10min，弃上清，同法在洗涤两次； (5) 沉淀细胞用适量10%～20% 灭活小牛血清的Hank’s液重悬，计数，配成所需的细胞浓度的悬液，一般常用2×106/min。 （2）.RNA提取 1ml外周血中加入3ml红细胞裂解液 ↓ 颠倒混匀，室温放置5min ↓ 3000rpm离心5min ↓ 弃上清。留下白细胞沉淀（或者1：1的比例裂解，重复三次） ↓ 加入1ml Trizol裂解白细胞 ↓ 用枪将其移至EP管中反复吹打至完全分散 ↓ 用5ml注射器反复吹打（不少于10次） ↓ 再用1ml注射器反复吹打 ↓ 加入1/5总体积的氯仿（200ul），颠倒混匀，室温放置5min ↓ 4℃离心：12000rpm 15min ↓ 转上层水相450ul于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置15min ↓ 4℃离心：12000rpm 10min ↓ 弃上清，加入预冷的75%乙醇（800-1000ml） ↓ 4℃离心：7500rpm 5min ↓ 弃上清，将EP管倒置于吸收纸上，室温放置风干 ↓ 将RNA重新溶于30ul（或者20ul）水中 ↓ －80℃冰箱保存，备用 1、取5ulRNA进行琼脂糖凝胶电泳（使用DEPC水配置） 2、取1～2ul总RNA进行浓度以及纯度测定 西南大学物理科学与技术学院 2004级物理学3班 hzx 目的基因与克隆载体的体外重组 1、用限制性内切酶消化质粒与目的基因 2、苯酚|氯仿抽提及乙醇沉淀法纯化被消化的外源性DNA片段和载体D