诱变筛选荧光假单胞菌M18的高产PCA菌株研究.pdfVIP

诱变筛选荧光假单胞菌M18的高产PCA菌株 狄海峰 刘建涛 许嫂泉 (上海交通大学生命科学技术学院，上海200240) (上海植保有限公司 ) 摘要 研究了NTG的诱变荆全、处理时间以及氛化钠浓度对歼生型荧光很单胞菌M18致死率的影响， NT(;的诱变别125-200pg/ml，处理时间10至30分钟范围内，随着诱变别剂f增加和时问的延长， 徽生物的存活率不断下降oNTG的作用荆t25pg/ml，处理时间10分钟时，细苗存活率为55%左右。 利用细苗存活率为55%时的诱变条件，经生物浏定，初筛获得20株抑菌效果明显的诱变林。经摇瓶 发醉复筛，从这20株诱变株中，获得PCA高产诱变株N0.7。在同样发酵条件下，其发酵效价比歼生 型提高产童一倍左右 关健词 荧光低单胞菌M18,份嗓一I一魏酸 (PCA),NTG,效fti率 X 引言: 梭基吩嗓 (Phenazine一。arboxylicacid)，是吩臻的一个重要衍生物。在荧光类假单胞菌的生物 防治中，PCA是主要的一种抗真菌物质。19%年，本实验室从上海郊区甜瓜地的根际土壤中分 离到荧光假单胞菌株M18，该菌株同时具有广谱抑制植物真菌性病原菌和促进植物生长的双重功 能，经分析鉴定，已确定它分泌的抑制真菌物质为PCA。为提高M18菌株发酵值，本实验对野 生烈菌株M18进行NTG诱变筛选，研究了诱变条件和细菌致死率的关系，获得了发酵效价提高 近一倍的M18诱变菌株No.7a 1 实验材料 1.1菌种 本研究室分离保存 1.2 试刑及仪器 蛋自陈:上海大肠肉类联合加工厂 甲醇:上海生生化工助剂厂 其它试剂为国产分析纯试剂 LC-1OAtvp高压液相色谱仪，日本岛津公司生产 1.3 培养基 灭菌条件:1.03x1口Pa,12190，15min 1.3.1斜面种子培养基:King，B培养基基础上加20g/L琼脂 1.3.2 小瓶种子培养基:KingsB培养基 1.3.3分离单菌落培养基，初筛培养基为PPM加20g/L琼脂 1.3.4 大瓶发酵培养基PPM (L’):蛋白陈20g，葡萄糖18g,KNO,5g,NaCllg，用NaOH调pH 至 7.0 2 实验方法 2.1 实验流程 原菌种~斜面培养、液体培养~菌种诱变处理、平板分离培养~生物测定，初筛、大瓶发 酵复筛 ，诱变菌株保存 2.2 诱变处理 原菌株在King。B斜面28℃活化24小时后，接种进小瓶，28℃旋转摇床220转/分条件下 98 培养20小时，然后，接种到小瓶中，28℃继续培养24小时。诱变处理时，离心收集菌体，柠檬 酸洗涤两次，最后用柠檬酸缓冲液加至菌体直到OD-、为0.6。菌株诱变处理参考文献 2【]. 2.3 平板生物测定初筛 诱变菌稀释液涂布平板，2890培养两天后，用牙签将分离单菌落在离平皿中心均等距离处， 逐 一点样到生物测定平板上，28℃培养24小时，平皿中心接人病菌，挑选抑菌圈半径/菌落半径 比例最大者，进行摇瓶复筛。 2.4 摇瓶筛选 初筛菌种289C斜面活化24小时后，用接种环接人至50mL(250mL)的摇瓶液体发酵培养基 11在28C、摇床转速220r/min条件下培养过夜后，按5%的接种量接人150mL(500mL)的摇瓶 液体发酵培养基中，培养温度28C，摇床转速220r/min. 2.5 PCAAl!定方法 发酵样品PCA的提取及测定方法参阅文献 [3]。发酵培养液先用2倍体积氯仿萃取，调pH 到2.0，弃上清，反相高效液相色谱分析:流动相为甲醇:水 (60/40),C18，柱温4090。进样体 积孙!。PCA标准品由本实验室化学合成。 3 结果与讨论 3.1NTG作用剂黄时存活率的影响 以M18为出发菌株，分别将诱变处理后的样品和对照样品的逐级稀释，涂板，2890培养2 大，计菌落数。以每平板内单菌落数在30一300之间的稀释度为标准，计算存活率。 衰1NTG剂.处理时间与存活率关系衰 (细菌存活率为百分率》 存水浴时间 NTG浓度 (1`g/ml) (分)