环境因子对井冈霉素发酵调控的影响及其机制探索研究.pdf

摘要 井冈霉素又名有效霉素A，是我国及东南亚地区应用最广的防治真菌病害的 农用抗生素之一，对水稻纹枯病的防治效果最佳。通过环境因子筛选得到对发酵 有促进作用的重要因子对工业化生产提高产量降低生产成本具有重要参考价值。 在吸水链霉菌5008发酵生产井冈霉素的过程中受到一系列环境因子的影响，在 细胞内产生多层面的响应与应激，从而影响到次级代谢物井冈霉素的产量和产素 效率。本研究从影响井冈霉索发酵的环境囚子筛选入手，考察了有机溶剂、温度、 植物油、氨基酸、Y_丁内酯、脲等因素对发酵的影响，筛选到乙醇、氨基酸、十 丁内酯和脲等多个对井冈霉素生产有促进作用的囚素。由于乙醇的效果最为明 显，详细考察乙醇影响下的井冈霉素的发酵，通过乙醇添加使井冈霉素产量提高 至约20 g／l’增产近60％。确立了通过乙醇添加促进井冈霉素增产的最优添加策 略，为醇类添加提高其它抗生素产譬提供了借鉴。 发酵12h时添加微量乙醇，使产素效率得到大幅提高，而且细胞发酵后期 自溶变慢。进一步使用qRT-PCR测定了乙醇处理组与对照组在4i同发酵时期的 井冈霉素生物合成必需的8个基冈所在的3个操纵子的转录水平以及全局调控基 和全局调控基冈咖R、glnR转录水平都迅速提高。咖尺和glnR的调控都需蛋白 激酶的介导，因此使用蛋白激酶抑制剂与乙醇同时添加，结果显示可使产量恢复 到原始水平。外源乙醇添加后，也可观察到胞内乙醇浓度的提高和胞内活性氧信 号分子的响应，同时伴随培养液颜色的加深。在动物细胞中乙醇可作为分子信号 诱导胞内活性氧产生，调节细胞的生长与凋亡，但在微生物体系中尚无深入研究， 特别是我们观察到乙醇与活性氧信号的相关性，为进一步以链霉菌为模型研究两 I}0■一．■■■■●●■IIr 种信号分子对次级代谢的调控机理和作用方式提供了重要信息。 井fxJ霉素的合成与碳代谢密切相关，乙醇处理组在处理后的48h内，胞内 磷酸戊糖途径的关键酶6．磷酸葡萄糖脱氢酶和糖酵解途径的关键酶3．磷酸甘油 醛脱氢酶都具有更高的酶活。可见，微量乙醇的添加除可影响吸水链霉菌的发酵 颜色、细胞状态外，还可以增强主代谢使井冈霉素获得更多的合成前体。加之前 I 面提到由其引起胞内活性氧和全局调控因子的响应，调控胞内信号转导途径对其 结构基因进行调节，结构基因的高表达也将带来井冈霉素产素效率的提高。本研 究从信号转导、基因转录、酶活力及代谢流分布角度揭示了微量乙醇影响下的井 冈霉素合成效率提高的机制，其研究方法和思路在其它次级代谢物发酵调控研究 中具有参考价值。 关键词：井冈霉素，吸水链霉菌，发酵，环境因素，乙醇，次级代谢，基因转录， 信号转导，酶活力 Ⅱ ／一／／／丫／／／／／z／／／／／／u／／／／／／6／／／I／／z／／／／／／8／／H／／o／／／／／／6／／／／／／ Abstract Aisoneofthemost used antibiotics Validamycin widelyagricultural against sheath East rice diseases，inAsia．Screen