卡巴氧致突变作用的分子机理研讨.pdfVIP

卡巴氧致突变作用的分子机理研究 陈倩郝利华齐以涛肖希龙 (中国农业大学动物医学院药理组，北京，100094) 摘要：本文将短暂复制型穿梭质粒pSPl89与非洲绿猴肾细胞(Veto细胞系)组成穿 梭质粒／哺乳动物细胞诱变检测系统，检测卡巴氧的请变性，通过对靶基因Sup／{RNA序列 的分析得到了卡巴氧对其DNA一级结构上的作用位点、突变类型和突变序列特异性等信息。 转化E．coliMBM7070指示茵筛选突变体。结果显示卡巴氧处理组的突变频率明显高于溶剂 对照组；对38个突变子质粒靶基因进行序列分析，发现卡巴氧引起质粒靶基因核苷酸序列 改变主要表现为点突变、缺失和单碱基插入，且以引发点突变为主，占突变总敷的76％。 点突变发生在G：C碱基对．部分位点包含在5’一NNTTNN一3’的序列中，其中的N住易 发生突变，而连续缺失的序列包含在合ANGGccNA从的序列中；插入的单碱基主要是A． 75％的插入位点集中在CC之间。 关键词：穿梭质粒；Vero细胞；突变；卡巴氧 FtRNA的 psPl89是基于sv-40病毒的新型穿梭质粒，是一个质粒群，它在其靶基l★lSup F是酪氨酸tRNA 3，端插入了1段随机产生的8bp的标示序列，可区别其突变的独立性0-31，,Sup 琥珀突变抑制基因，能校正宿主大肠杆菌MBM7070携带的编码D2’p乳糖茁酶的LacZ基因的 琥珀型突变，恢复其分解乳糖的能力，在有相席底物存在的琼脂平板上长成蓝色菌落；一臣 SupF发生任何突变，宿主便失去了分解乳糖的能力，菌落则呈白色，由此很彝易地筛选出突变 体m,4-5,11,14】。 喹嚼啉类药物分子结构有很大的相似性，均为喹叨嗪的衍生物，喹叨嗪由于其遗传毒性 被禁用，而这类曲物被怀疑有类似的遗传毒性睁…。卡巴氧为人工合成的喹嘴啉类抗卣药． 具有提高饲料效率、促进动物生长和广谱抗菌的作用，此外还有抗球虫作用。最初作为猪、 牛和家禽抗菌促生长剂使用，而现在仅用作猪饲料添加剂。 本研究目的是用穿梭质粒pSPl89／哺乳动物Vem细胞系统检测#巴氧的诱变性，并探讨 卡巴氧对质粒靶基冈sl啦FtRNA上作用的位点、诱变类型及序列特性，在DNA水平上为卡巴 氧的诱变机理提供依据，从而指导实践用药。 1材料与方法 1．1实验材料 1．1．1细胞、质粒及其宿主菌 穿梭质粒pSPl89及其宿主菌E．CoIi 赠送。Vem细胞由浙江省医学科学院病毒病研究所柴少爱副所长惠赠，在含lxl05U，L青霉 17l 素、lOOmg／L链霉素、10％小牛血清的DMEM培养基中常规培养。 1．1．2试剂 P巴氧(99％)，Sigma公司产品；转染试剂盒Lipofectamine2000、DpnI内切酶，Promega 公司产品；x—gal、IPTG，Gibco公司产品：其它试剂均为国产和进口分析纯。 1．2实验方法 1．2．1质粒染毒及转染 转染前一天接种5×105个细胞丁：25cm2培养瓶中，用无双抗的DMEM培养基常规培养 粒30min，形成质粒DNA一忙巴氧加台物m 转染，按说明书操作。转染细胞在含10％小牛血清的DMEM培养基中常规培养48—72小 时后收获质粒。 1,2．2质粒同收 从Vero细胞中回收质粒按Seidman提供材料操作。 1．2．3质粒转化宿主菌及筛选突变体 和IPTG(20％)的LB州体培养基上筛选突变体。监色菌落为野生型，白色菌落为突变型， 两色平皿划线确定突变表型。 1．2．4突变体质粒DNA的提取及琼脂糖凝胶屯泳鉴定 碱裂解法提取突变体质粒DNA，并在1．0％的琼脂糖凝胶电泳上观察电泳迁移改变，确 定突变体质粒DNA有无大的缺火和重组。 1．2．5 突变体质粒DNA靶基因SupFtRNA序列测定1j作由上海生二【：完成。 2结果 2．1卡巴氧诱发质粒pSPl89靶基冈SupFtRNA突变频率分析 宿土苗在含Amp、X—gal和IPTG的LB同体培养基上筛选突变体。结果表明：溶剂对照组 获得的29781个转化子中有6个白色突变子，突变频率为2．01×10-4，表明该系统具有较低 的白发突变频率；经过