白肌病细胞模型中SelW mRNA的定量研讨.pdf

白肌病细胞模型中SelWmRNA的定量研究 王晓龙 东北林业大学野生动物资源学院动物医学系。罴龙江哈尔滨，150040 摘要SclW蛋白由于箕骨骼肌组织素嗜性被认为是与白肌痛关系密切的舍硒蛋白． 定量研究其基因耄化有助于准确反映痰藕进程中幂同阶段的特点．目前国内外尚元定量研究 的相关记录．在建立了定量检制方法后。以常硒组为对照，应用蕾方法对白肌病不同发展阶段 M组 且髓反映SelW基因相对予白肌病不弼发展阶段的薰的变化，即硒浓度3×101 (o．080)．研究结暴对临床诊疗具有一定的糟导意叉． 关键词 白肌病 肌细胞1w定量RT_PCR 白肌病是由于硪缺乏而引起并可导致动物死亡的一类常见病和多发病n]，老虎、大羚羊、狒狒等40多 种野生、经济动物、家畜均有掇道秘】。员然其临床症状特异，防治效果明显，但世界各阐郝无法完垒控制白 给纛之闻的特殊荧系[s】，人们开始重囊关注囱肌病的发生机瑗；其未知构分子病理学机嗣更引起学卷们极 检测镁域尚祸空白的情况下。将适H重荧光定量R}PCR技术应用予白肌病细胞模型中检测SelW 的动态变化为磷究SeIW加RNA的变化与痰病之间的内在关系提供了必要的参考． 一、材料和器材 (一)试弃J R鼬l One R’卜PCRkil(PeffectTime)。RT—PCR Tr．zoI(in、ritrogen)；or掉stepSyber step easy载体·DNA 胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；T4DNA莲接酶、pGEM—T 程公司IDMEM高糖培养纂．Ham’8 氯仿，异谱醉。乙醇，以上常规试剂均为分柝纯，购自Sig姐公司． (二)实验仪器 rea卜time Rolor-ge舱3000 Gef— DU巧40t 洋)，普通冰箱(海尔)，超净工作台(苏净集跚安泰公司)，綮外分光光凌计(BEcKMAN 系统(Syngene，USA)，剩球橇(S∞tsman，獒国)．超纯水仪(Milli—Q)． ·73· 二、实验方法 (一)适时RT—PCR条件的建立 1．适时荧光定量RT—PCR引物的设计 time 与常规PcR引物的设计要求不同．除要满足常规PcR弓l物设计的囊求外，R髓lPCR的引物 设计还有着特殊要求。可以说对弓I物的要求更高、更严格．是Real—tilne PCR成败的第一个决定因素， 量一般应为40％～60％。最好为45％～55％． (5’c][：^融AGoC(’AAGlIAC5’C陷∞盯0CAC蓖盼GOC加陀AC c】呛CA3’I 3’)和看家基因扩增引物 (5’^GGAc(’TG弘cG(c 。 2．细胞培养 性细胞，霹见细长、多角形及不规则细胞，培养的瓿细胞从单个核期进入食体细胞阶段时开始捆匿拉网． 大量增殖的肌细胞椎蔑融台。形成核位于中央的多核性长管状初生肌管，肌管形成的时同不一，有的细 胞相对缓慢，此后肌管敷蒙增多t体积增大，