浅谈在制备电镜样品技术工作中的体会.docVIP

精品论文 参考文献 浅谈在制备电镜样品技术工作中的体会 唐新萍1余洪水2张培谊1黄小丽1王玉兰1 　　1兰州军区乌鲁木齐总医院病理科甘肃兰州830000; 　　2新疆和田市93926部队新疆和田848000 　　【中图分类号】R319 　　【文献标识码】B【文章编号】16748999(2013)12041901 　　在21世纪的今天，电子显微镜早已在人们生活的各个领域得到普遍应用，而在整个电子显微镜的应用中，电镜样品制备技术的好坏，对电镜的诊断起到关键的作用，想获得一张满意的切片，在制片过程的每个环节都不可忽视，否则将给电镜观察者带来很多困难［1］。我科从1993年～2013年对各种组织制片进行了研究和探讨，经过不断的改进，取得了一定的经验： 　　1电镜样品的前期准备 　　1．1组织取材：利用戊二醛固定效果好的特点（戊二醛配制：25%的戊二醛80ml、02M磷酸缓冲液420ml），对致密、难浸透的组织延长固定时间，对不易成团的脱落细胞，离心弃上清液后，沿管壁加入固定液使之成团，然后切成1mm3的小块。 　　1．2组织脱水：采用快速的电镜样品制备技术4%戊二醛固定2h后，001%PBS冲洗4次，每次5min；1%饿酸后固定1h，001%PBS洗4次，每次5min；50%丙酮、70%丙酮、80%丙酮、90%丙酮各脱水一次，10min；100%丙酮2次，每次10min。 　　1．3组织浸透：低粘度包埋剂（Epon812：6ml、MNA：4ml、DDSA：5ml、Dmp30：01ml）与丙酮1:1混合浸透1h，1:3混合浸透25h～3h，纯包埋剂浸透3h，平板包埋70℃烤箱过夜。 　　1．4组织包埋：包埋剂使用Epon812，搅拌40min，室温下静止20min；低粘度包埋剂在聚合前后体积变化小，组织无变形，切割性能好，制出的切片不仅透明度好，也有足够支撑力，可完全达到临床病理电镜诊断的要求［2］。 　　2电镜样品切片与染色 　　21半薄切片定位：为准确观察和提高诊断准确率，超薄切片前都要进行半薄切片定位，定位时可根据半薄切片的形态特征，将组织块修成梯形，上下边不要与组织游离缘平行，最好倾斜成一定的角度或垂直，使切片中不因组织与树脂密度明显不匀而出现交替切片、薄厚不匀的现象；半薄切片用1%甲苯胺兰染色（甲苯胺兰的配制：05g甲苯胺兰、05g硼砂、双蒸水50ml）定位。 　　22超薄切片技术：是电镜制片中的关键，对最后的电镜观察有很大的影响：①对刀：为了使组织达到最大的切面积，要求切面与切缘位置在垂直和水平方向上都要有较高的准确度；②预修：调好刀与组织块后，先在左边刀预修，观察组织面是否切全及平整，若切面未切全，可将刀座稍后移一点，再略调切面的垂直，最终将切面修全；③移刀口：对刀口相对平直者，移刀时先把刀座向左移动少许，如不平直，制刀时应按顺序摆放，便于掌握使用；④切片：因观察需要，切面比常规大几倍，切片时难以一次切全，此时不移动刀口，将刀座向未切全的半边切面移动少许，对软硬不同的组织块应将硬侧放下边，从硬侧切到软侧［3］。 　　23染色：醋酸铀染色15min（1g醋酸铀、50%的乙醇50ml）硝酸铅染色20min（硝酸铅133g、柠檬酸三钠176g、氢氧化钠04g、双蒸水50ml、PH12棕色瓶子黑纸包裹置4℃冰箱保存）。 　　3讨论 　　电镜样品在固定、脱水、浸透、半薄切片、超薄切片及染色整个制样过程中，只有每步都精心的高质量完成，才能制出无刀痕、皱褶、空洞、颤痕、厚薄不均等完美的优质电镜切片。在近二十年来，我们对各种组织电镜标本的制做方法进行了不断的改进，经过改进后的制片方法，脱水要求不高，聚合时间短，切片容易，染色后反差好。在整个制样过程中，超薄切片是电镜技术中的难点，同时也是电镜制样技术的关键，首先包埋块应聚合良好［4］，软硬要适宜，根据季节的不同及不同的组织、不同的病变适当调节包埋剂的配方，因此具有丰富超薄切片技术实践经验的技术人员就显得非常重要了。超薄切片是切片中关键步骤，对切片结果有很大的影响，组织应达到最大的切片面积，为了确保诊断的需求超薄切片时应保证无皱褶、颤痕（重新制刀或检查样品头是否加紧）、厚薄不均、刀痕（可换刀位）的出现，制作一张高质量、完美的切片，便于电镜对细胞成分的全面观察和照像。我室采用改进的快速方法，不仅缩短了电镜的诊断时间，而且也保证了切片质量，给临床提供更有价值的诊断依据。 　　参考文献 　　［1］王泊云，李玉松等主编. 病理学技术［M］. 人民卫生出版社，2001:948953 　　［2］唐新萍，邹赛英，邱敬芝，等. 肾穿组织快速电镜制样技术探讨［J］. 西北国防医学杂志，2004:25（4）：318 　　［3］陆珍凤，周晓军，石群立，等 电镜超薄切片常见